肿瘤防治研究  2014, Vol.41 Issue (01): 5-8.   PDF    
引用本文
傅岳武，潘运龙，覃 莉，赵晓旭，巫 青，蔡继业，刘英梅. 纳米金对裸鼠肝癌HIF-1α和VEGF mRNA表达及肿瘤血管的影响[J]. 肿瘤防治研究, 2014, 41(01): 5-8.   
FU Yuewu, PAN Yunlong, QIN Li, ZHAO Xiaoxu, WU Qing, CAI Jiye, LIU Yingmei. Effects of Gold Nano Particles on HIF-1α and VEGF mRNA Expression and Normalizing Vascellum in Hepatic Tumor of Nude Mice. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2014, 41(01): 5-8.  
纳米金对裸鼠肝癌HIF-1α和VEGF mRNA表达及肿瘤血管的影响
傅岳武1，潘运龙1，覃 莉2，赵晓旭1，巫 青1，蔡继业3，刘英梅4    
1. 510630广州，暨南大学医学院附属第一 医院普外科；
2.暨南大学医学院组织学与胚胎学教研室；
3.暨南大学生命科学技术学院纳米生物技术实验室；
4.中山 大学附属孙逸仙纪念医院心内科心脏超声室
收稿日期: 2012-09-25；修回日期：2012-01-15
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30772131);
国 家973计划资助项目（2010CB8033603）；
暨南大学附属第 一医院科研培育项目资助课题（511005004）
作者简介：傅岳武(1972-)，男，博士，副主任医师， 主要从事腹部外科临床与腔镜技术研究
通信作者：潘运龙，E-mail：tpanyl@jnu.edu.cn
摘要：目的 观察纳米金(goldnano particles,GNP)对裸鼠H22肝癌缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor, HIF-1α）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达及肿瘤血管 的影响。方法 Balb/c裸鼠14只，肝癌造模后，随机分两组，每组7只实验动物。GNP组：从肿瘤内注入 GNP（浓度为500 nmol/L）溶液0.2 ml；对照组：用等量0.9%氯化钠溶液处理，连续用药7d。超声多谱 勒分析肿瘤血管形态，测量肿瘤血管直径和血液灌注量；处死裸鼠时测量肿瘤体积，原位杂交检测HIF- 1α mRNA及VEGF mRNA表达。结果 (1)GNP组肿瘤体积(0.935±0.129)cm3较对照组(1.573±0.247)cm3 下降（P<0.05）。(2)GNP组肿瘤血管直径（0.6397±0.1548）mm及血液灌注量（1.171±0.241）cm3较对 照组血管直径（1.1000±0.3247）mm和血液灌注量（2.357±0.408）cm3减少（P<0.05）。(3)GNP组裸鼠肝癌组织HIF-1α mRNA（15.3±7.4）%、VEGF mRNA（23.7±9.5)%，均较对照组[(67.2±13.1)%，(70.3±14.6)%]明显降低（P<0.05）。结论 GNP可以使裸鼠肝癌血管形态趋于正常，降低肿瘤血液灌注；抑制HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表达，抗肿瘤生长。
关键词: 纳米金     肝细胞癌     肿瘤血管     血管内皮细胞生成因子     缺氧诱导因子-1α    
Effects of Gold Nano Particles on HIF-1α and VEGF mRNA Expression and Normalizing Vascellum in Hepatic Tumor of Nude Mice
FU Yuewu1, PAN Yunlong1, QIN Li2, ZHAO Xiaoxu1, WU Qing1, CAI Jiye3, LIU Yingmei4    
1.Department of General Surgery,The First Affiliated Hospital,School of Medicine,Ji’nan University,510630 Guangzhou,China;
2.Department of Histology and Embryology,School of Medicine,Ji’nan University;
3. Department of Nato-biotechnology,School of Life Science, Ji’ nan University;
4.Department of Cardiology,The SUN Yat-sen Memorial Hospital Affiliated SUN Yat-sen University
Abstract：Objective To observe the effects of GNP (goldnano particles,GNP) on nude mice hepatic tumor vascular morphology and the expression of hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA. Methods Hepatocellular cancer cell line H22 were injected subcutaneously into the right armpits of 14 Balb/c nude mice. When the diameter of transplanted tumor reached about 7-8 mm,they were randomly divided into 2 groups, and drugs with GNP or normal saline were injected respectively. For 7 days later, the tumor vascular diameter and blood volume were measured by Doppler ultrasound. When the mice were sacrificed, the tumor’s size was calculated and the expression of HIF- 1α and VEGF mRNA were detected by in situ hybridization. Results (1)The tumor’s size in experiment group (0.935±0.129 cm3) was decreased in comparison with that in control group (1.573±0.247 cm3), there was significantly difference (P<0.05).(2) The tumor’s vascular diameter and blood volume in experiment group were (0.6397±0.1548)mm and (1.171±0.241)cm3 respectively, they were all signifi cantly reduced in comparison with those in control group (1.1000±0.3247 mm, 2.357±0.408 cm3)(P<0.05). (3)The expression of HIF-1α mRNA (15.3±7.4%) and VEGF mRNA (23.7±9.5), were dramatically attenuated in comparison with those in control group [(67.2±13.1)%,(70.3±14.6)%] (P<0.05).Conclusion GNP can make nude mice tumor’s vascular morphology better and decrease their blood volume, inhibit the expression of HIF-1α mRNA,VEGF mRNA, this situation is benefi t to restrain the tumor growth.
Key words: Nanogold particles     Hepatic carcinoma     Tumor vascular     VEGF      HIF-1α    
0 引言

缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor, HIF-1α）存在于缺氧条件下，在多种肿瘤细胞 中表达，能促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的转录，加速肿 瘤血管形成，与肿瘤的生长、浸润密切相关[1]。纳 米金(gold nano particles,GNP)是金的微细颗粒，直 径多在1~100 nm之间，具有抗氧化性强、生物相 容性好，能与多种生物大分子结合无细胞毒性， 被广泛用于药物的载体[2]。既往实验证实，GNP能 促进微血管外壁的周细胞表型成熟，使肿瘤血管 壁结构趋于正常化[3]。它的作用能否改善肿瘤内缺 氧微环境、影响HIF-1α表达，目前还不甚了解。 为此，我们选用血管丰富的裸鼠肝癌动物模型， 观察用GNP处理后，肿瘤组织中HIF-1α mRNA、 VEGF mRNA的表达及肿瘤血管形态变化，探讨 GNP的抗肿瘤作用及可能机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物及主要试剂

Balb/c裸小鼠(nu/nu)14只，6周龄，体质量 为15~17 g，SPF级，由暨南大学实验动物中心提 供。肝癌H22细胞株购自中山大学医学院细胞冻 藏中心。HIF-1α mRNA原位分子杂交试剂盒和 VEGFmRNA原位分子杂交试剂盒(MK1142-)购自 武汉博士德公司。HIF-1α靶基因的mRNA序列为： 5'-GGAAGTGGCAACTGACAAGCTCATAA-3'； 5'-ACACACTGTGTCCAGTTAGTTCAAACTGAG -3'；5'-AGCATGATAATATTCATAAATTGAGCGG CC-3'。VEGF靶基因mRNA序列为：5'-ACCTCCA CCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACC-3'；5'- ATTGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTA CCC-3'；5'-ATCACCATGCAGATTATGCGGATCA AACCTCACCA-3'。探针为地高辛标记。DAB酶底 物显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术公司。 GNP合成原料氯金酸、枸橼酸钠购于国药集团化学 试剂有限公司。采用氯金酸还原法自行合成GNP。 1.2 纳米金的制备和表征

用改进的氯金酸柠檬酸三钠还原法制备 GNP，操作方法参照文献[4]。制备GNP原液粒径为 25 nm左右，用透射电子显微镜表征及紫外可见分 光光度计(UV-Vis)鉴定后，取部分原液稀释至浓度 为500 nmol/L，置4℃冰箱保存。 1.3 动物模型建立

6周龄Balb/c裸鼠(nu/nu)14只，称重。将H22肝 癌细胞1×106个（0.2 ml）种植到小鼠的右腋皮下。 移开针头后，按压注射部位约30 s，以防细胞稀释 液从针孔渗出。肿瘤最长径形成约7~8 mm大小， 随机分为两组。GNP组：从肿瘤周围及瘤内注入 GNP(浓度为500 nmol/L)溶液0.2 ml；对照组：用 0.2 ml的0.9%氯化钠溶液替代，其余处理方法同实 验组。各组每天用药1次，连续7 d。 1.4 超声观察肿瘤血管形态

超声多谱勒血流测定仪观察每只裸鼠用药7 d 后的肿瘤血管形态，肿瘤血管通透性。测量肿瘤 血管直径；检测肿瘤区血流频率和阻抗系数，计 算肿瘤内血液灌注量。 1.5 肿瘤体积检测

处死裸鼠，收集肿瘤标本。测量肿瘤长径和 短径，应用公式：长径×短径×短径×0.52，计算肿 瘤体积。肿瘤称重，10%福尔马林溶液固定标本。 1.6 肿瘤组织中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA测定

HIF-1α mRNA和VEGF mRNA测定采用原位 杂交方法。实验步骤如下：（1）取已石蜡包埋的 肿瘤标本。常规制备5~6 μm厚连续切片多张，切 片脱蜡至水洗，3%H2O2甲醇液室温下处理10 min 后，蒸馏水冲洗。（2）室温下，滴加3%胃蛋白酶 消化20 min后，取pH值为7.2的PBS液洗3次，每次 5 min。（3）滴加杂交液孵育，37℃过夜。（4） 滴加封闭液，室温下20 min。滴兔抗地高辛，37℃ 孵育60 min，0.5 mol/L PBS缓冲液洗3次，每次2 min。（5）滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，0.5 mol/L PBS液洗4次，每次5 min。DAB显 色20 min，充分水洗。脱水透明,中性树胶封固。 以细胞中染成棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片 中选取着色最丰富的5个区域，200倍显微镜下 计数阳性标记的细胞数，取平均值，计算HIF-1α mRNA和VEGF mRNA阳性表达的百分比。 1.7 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，以均 数±标准差(x±s)表示，各组间均数比较采用单因素 方差分析，组间两两比较采用方差分析的SNK-q检 验，以P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 GNP的鉴定及透射电子显微镜表征

透射电子显微镜观察下GNP颗粒呈圆形、分 散，粒径稳定，未见到明显团聚，颗粒长径大小为25 nm左右；UV-Vis吸收光谱显示GNP的最大吸 收峰在520 nm处，见图1。

图1 纳米金的电子显微镜图像（×18 000） Figure1 The image of gold nano particles(GNP) observed by electron microscope（×18 000）
2.2 GNP抗肿瘤生长作用

肿瘤体积测量结果显示,对照组肿瘤体积为 (1.573±0.247)cm3，实验组为(0.935±0.129)cm3，两 组比较其差异有统计学意义（P＜0.05）。 2.3 GNP对肿瘤血管形态的影响

超声多谱勒显示：实验组肿瘤血流分布均 匀，血管形态趋于正常。实验组与对照组相比 肿瘤血管直径[(0.6397±0.1548)mm vs. (1.1000± 0.3247)mm]及肿瘤血液灌注量[(1.171±0.241)cm3 vs. (2.357±0.408)cm3]均有所下降，两者之间差异有统 计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 超声检测裸鼠肝癌血管分布及血液灌注 Figure2 Diameter and volume of tumor vessel detected by Doppler ultrasound
2.4 GNP对肿瘤组织中HIF-1α mRNA和VEGF

mRNA表达的影响 原位杂交检测裸鼠肝癌组织中HIF-1α mRNA 和VEGF mRNA表达，其结果显示，GNP组中 HIF-1α mRNA(15.3±7.4)和VEGF mRNA (23.7±9.5) 表达较对照组HIF-1α mRNA(67.2±13.1)和VEGF mRNA(70.3±14.6)均有所下降，两者之间差异有统 计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 裸鼠肝癌组织中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的阳性表达(分子原位杂交技术 ×200) Figure3 The positive expression of HIF-1α mRNA and VEGF mRNA in hepatic tumor of nude mice(in situ hybridization ×200)
3 讨论

HIF-1α是机体在缺氧条件下诱导的一种核转 录因子，它在细胞缺氧信号途径中处于核心位 置。HIF-1α高表达能增强细胞在缺氧环境下的生 存能力，使肿瘤细胞分泌更多VEGF，促进血管 生长和肿瘤细胞恶性转化，与肿瘤不良预后密 切相关[5]。在本研究中，我们发现GNP组HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表达量较对照组明显下降 （P＜0.05），并且肿瘤体积亦较对照组亦明显 缩小（P＜0.05）。这说明GNP能通过抑制HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表达，抗裸鼠肝癌生长。

既往细胞实验证实GNP能与VEGF结合，使 VEGF促血管生成作用失效，抑制内皮细胞增殖 及血管生成[6]。在本实验中，GNP组裸鼠HIF-1α mRNA表达低于对照组；GNP组裸鼠肝癌血管直 径及血液灌注量分别为(0.6397±0.2548)mm、(1.671 ±0.741)mm3；亦较对照组明显减少（P＜0.05）。 GNP能使裸鼠肝癌血管分布减少，降低肿瘤内滋 养血管直径，减少肿瘤组织内异常血流灌注。超 声观察到此时裸鼠肝癌血管形态较均匀，趋于正 常血管。说明GNP可以使裸鼠肝癌血管正常化， 改变肿瘤内的代谢微环境。由于肿瘤的特性是表 现为肿瘤组织内血流分布不均匀，无效血液循环 增加，肿瘤内部呈现渗透压高、缺氧的代谢微环 境，刺激HIF-1α高表达[1, 7]。GNP通过对裸鼠肝癌血 管的影响，改善肿瘤内部灌注压高、缺氧的代谢微 环境，达到抑制HIF-1α mRNA高表达状态，发挥抗 裸鼠肝癌生长作用。这与既往实验证实GNP能促进 肿瘤血管外壁周细胞表型成熟，使周细胞间连接相 对致密，减少肿瘤血管壁的渗漏性，抑制肿瘤细胞 沿血管播散和转移的研究相一致[3, 8]。

本实验说明，纳米金抗裸鼠肝癌生长不仅能 通过抑制肿瘤血管生成来实现，也可以是由于正 常化肿瘤血管、改善肿瘤内部缺氧的代谢微环 境，延缓肿瘤细胞的恶性转化来实现。GNP的这 种生物学特性能否增敏放、化疗抗恶性肿瘤生长 作用，还有待课题研究的进一步深入阐明。

参考文献
[1] Rey S,Semenza GL.Hypoxia-inducible factor-1 dependent echanisms of vascularization and vascular remodelling[J]. ardiovasc Res,2010,86(2):236-42.
[2] Liu WJ,Gu XH,Ding Y,et al.Application of gold nanoparticles n anticancer research[J].Xian Dai Sheng Wu Yi Xue Jin han,2010,10(5):982-5.[刘文佳,谷小虎,丁轶,等.纳米金在抗 瘤研究中的应用[J].现代生物医学进展,2010,10(5):982-5.]
[3] Fu YW,Pan YL,Qin L,et al. Inhibition of Ang-2 and RGS-5 xpression by nanogold results in normalization of vascellum n hepatic tumor [J].Zhongguo Bing Li Sheng Li Za Zhi, 011,27(12):2247-50.[傅岳武,潘运龙,覃莉,等.纳米金抑制 ng-2和RGS-5表达导致裸鼠肝癌血管正常化[J].中国病理生理杂志,2011,27(12):2247-50.]
[4] Pan YL,Zhao XX,Qin L,et al.The sensitization of gold anoparticles on epirubicin[J].Zhonghua Shi Yan Wai Ke Za hi,2011,20(4):533-5.[潘运龙,赵晓旭,覃莉,等.纳米金对表阿霉 的增敏作用[J].中华实验外科杂志,2011,20(4):533-5.]
[5] Kim SE,Shim KN,Jung SA,et al.The clinicopathological ignificance of tissue levels of hypoxia-inducible factor-1alpha nd vascular endothelial growth factor in gastric cancer[J].Gut iver,2009,3(2):88-94.
[6] Pan YL,Qiu SY,Qin L,et al.Observation of molecular interaction etween goldnanoparticle and VEGF165 with atomic forcem croscope[J].Zhongguo Bing Li Sheng Li Za Zhi,2010,26(12):2 95-300.[潘运龙,邱思远,覃莉,等.纳米金与VEGF165分子作 的原子力显微镜研究[J].中国病理生理杂志,2010,26(12): 295-300.]
[7] Vaupel P,Mayer A. Hypoxia in cancer: signifi cance and impact on linical outcome[J].Cancer Metastasis Rev,2007,26(2):225-39.
[8] Welen K, Jennbacken K, Tesan T,et al.Pericyte coverage decreases nvasion of tumor cells into blood vessels in prostate cancer enografts[J].Prostate Cancer Prostatic Dis,2009,12(1):41-6.