Comparison of rhG-CSF and rhGM-CSF Mobilization on Quantity and Function Change of Dendritic Cell-based Tumor Vaccine via Human Peripheral Blood Monocytes
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摘要: 目的 探讨利用人外周血单核细胞制备树突状细胞（dendritic cell, DC）疫苗过程中，使用重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF）进行动员的临床应用可行性，并比较两者作为动员试剂的优劣。方法 对2011年8月至2013年12月中国人民解放军第81医院肿瘤生物治疗科进行DC疫苗治疗的恶性肿瘤患者134例进行随机分组，其中rhG-CSF动员者69例，rhGM-CSF动员者65例。rhG-CSF动员组在血细胞分离机采集前1天行rhG-CSF皮下注射3 μg/(kg·d)，rhGM-CSF动员组在血细胞分离机采集前1天行rhGMCSF皮下注射3 μg/(kg·d)。比较两组动员前后血常规变化的差异；分析两组采集终产品中单个核细胞（mononuclear cell, MC）数量及表型，检测体外培养所得DC的数量、表型及细胞因子的表达。结果 动员后rhGM-CSF动员组单核细胞增高值高于rhG-CSF动员组（P≤0.001），但中性粒细胞计数增高值低于rhG-CSF动员组（P≤0.001），其余血常规项目两者差异无统计学意义。rhGMCSF动员组采集终产品中单个核细胞数量高于rhG-CSF动员组（P=0.046），而CD14+单核细胞的比例两组差异无统计学意义。rhGM-CSF动员组最终诱导所得DC数量高于rhGCSF动员组（P=0.011），且DC细胞表面分子HLA-DR的表达高于rhG-CSF动员组（P=0.001），其余CD80、CD86，CD83、CD11C、CD54表达两组差异无统计学意义。两组DC细胞Th1型和Th2型细胞因子的表达差异都无统计学意义。结论 在用人外周血单核细胞制备DC疫苗的过程中，使用rhGM-CSF动员比rhG-CSF更有优势。
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关键词:
- 肿瘤 /
- 树突状细胞疫苗 /
- 重组人粒细胞集落刺激因子 /
- 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 /
- 单核细胞
Abstract: Objective To investigate the clinical application of recombinant human granulocyte colonystimulating factor(rhG-CSF) and recombinant human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor(rhGM-CSF) mobilization on human peripheral blood monocytes for dendritic cell-based tumor vaccine. Methods We randomly divided 134 tumor patients using dendritic cell(DC) vaccine in the Ceuter of Tumor Biological Therapy, 81 Hospital of PLA from August 2011 to December 2013 into two groups as follows: rhG-CSF group (n=69) and rhGM-CSF group (n=65). rhG-CSF group were injected rhG-CSF subcutaneously 3μg/(kg·d) and rhGM-CSF group were injected rhGM-CSF subcutaneously 3μg/(kg·d) before apheresis using a blood cell separator. Blood routine examination was taken before and after mobilization. The number and phenotype of peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) in final apheresis products of two groups were analyzed as well as DC numbers. The phenotypes of DC and cytokines expression were analyzed. Results After mobilization, peripheral blood monocytes counting of rhGM-CSF group were higher than that of rhG-CSF group, while neutrophil counting were lower(P≤0.001). There was no significant difference in other two blood routine examination items. The PBMCs quantity of rhGM-CSF group was greater than that of rhG-CSF group(P=0.046) as well as DC quantity(P=0.011). The CD14+ monocytes to mononuclear cell ratio of the two groups showed no significant difference. The surface molecule HLA-DR expression of DC cells in rhGM-CSF group were higher than that in rhG-CSF group(P=0.001) while no significant differences in the expression of CD11C, CD80, CD86, CD83 and CD54 were found between two groups. Th1 and Th2 cytokines expression of DC showed no difference between two groups. Conclusion rhGM-CSF mobilization is better than rhG-CSF mobilization in the progress of preparing dendritic cell-based tumor vaccine via human peripheral blood monocytes. -
0 引言
结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，包括结肠癌、直肠癌和肛门癌；全国范围内其死亡率呈现明显上升趋势[1]。中国2011年恶性肿瘤死亡顺位中结直肠癌位居第5[2]；城市地区和男性人群中结直肠癌疾病负担较为严重[3]。结直肠癌是与社会经济及生活方式密切相关的癌症[4]。昆山市位居上海与苏州之间，特殊的区位优势，近几十年社会经济快速发展，恶性肿瘤粗死亡率呈现上升趋势[5]，但是有关结直肠癌死亡率及时间趋势的研究证据有限。本研究基于江苏省昆山市1981—2014年肿瘤登记与死因监测，探究结直肠癌死亡率的时间趋势，为有针对性开展结直肠癌防治提供流行病学依据。
1 资料与方法
1.1 数据来源
江苏省昆山市于1981年全面开展全人群死因监测工作[5]；昆山市所有社区卫生服务机构及医院开展死因常规监测，同时疾控中心通过定期与公安、殡葬、妇幼保健及福利院等多部门合作，多途径收集死亡名单并开展死亡原因调查；市镇两级从业人员通过定期举办培训班、认真规范填写死亡证、逐条数据审核、现场督导检查及定期开展漏报调查等方式，来保证全市死因监测工作的质量。此外，也与苏州大市范围内的其他县（市）进行数轮的数据质量互审，重点对数据的完整性、原始数据的逻辑性、统计分类及ICD-10编码以及是否重卡等进行检查、修正。昆山市所有死亡病例开具《居民死亡医学证明（推断）书》其登记报告项目包括：（1）病例人口学特征（姓名、性别、出生日期、民族、婚姻、文化程度、职业等），（2）死亡信息：死亡原因（直接死因、间接死因、根本死因以及其他重要医学情况）、死亡日期、死亡地点等。（3）诊断信息：疾病最高诊断单位、疾病最高诊断依据等内容。（4）调查记录。有关昆山市肿瘤登记工作介绍详见参考文献[5-6]。年初与年末人口数来源于昆山市公安局，以计算年均观察人年数，1981—2013年年均观察人年数（年均人口数）详见参考文献[5]。
按照《国际疾病分类》（ICD-10）对所有恶性肿瘤疾病进行编码，结直肠癌ICD-10编码为C18-21。1981—2005年结直肠癌死亡数来源于死因监测报表；2006—2014年结直肠癌死亡数来源于昆山市肿瘤登记数据库。根据《中国肿瘤登记工作指导手册》[7]，对历年原始数据进行审核与质量评估。其中昆山市2011年肿瘤死亡发病比为0.59、DCO%为1.02%，病理诊断率为65.87%，数据的完整性和可靠性在可接受区间[6]。
1.2 统计学方法
依照历年结直肠癌分年龄与性别的死亡数，计算粗死亡率和年龄标化死亡率（age standardized rate,ASR）；年龄标化率采用第五次全国人口普查（2000年）人口年龄结构[7-8]；以0~74岁累积率（%）来评价结直肠癌死亡风险大小。应用年度变化百分比（annual percentage change,APC）评价结直肠癌粗死亡率与年龄标化死亡率等时间趋势，以APC其95%置信区间（confidence intervals,CI）是否包含0为统计学显著性检验标准[9]。分年份、年龄、性别粗死亡率与年龄标化死亡率等计算以及绘图等采用SAS 9.3软件。
2 结果
2.1 1981—2014年结直肠癌死亡率趋势分析
在1981—2014年间，结直肠癌死亡共计2 888例，其中男性1 502例，女性1 385例。结直肠癌死亡病例数在男女合计（APC=1.4%,95%CI: 1.0%~1.8%）、男性（APC=1.7%,95%CI: 1.2%~2.2%）和女性（APC=1.0%,95%CI: 0.4%~1.6%）人群中明显上升。
结直肠癌粗死亡率在男女合计（APC=0.3%，95%CI: -0.1%~0.7%）和女性（APC=0，95%CI: -0.6%~0.6%）人群中没有明显变化；而在男性（APC=0.6%，95%CI: 0.1%~1.1%）人群中呈现上升趋势。从标化死亡率看，总体上结直肠癌标化死亡率在男女合计（APC=-2.4%,95%CI: -2.9%~-1.9%）、男性（APC=-2.2%,95%CI: -2.8%~-1.6%）和女性（APC=-2.7%,95%CI: -3.4%~-2.0%）人群中呈现下降趋势，见表 1、图 1。
表 1 江苏省昆山市1981—2014年结直肠癌死亡率分析Table 1 Mortality of colorectal cancer in Kunshan, Jiangsu Province, 1981-2014
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图 1 江苏省昆山市1981—2014年结直肠癌年龄标化死亡率趋势图Figure 1 Time trend of age standardized mortality of colorectal cancer in Kunshan, Jiangsu Province, 1981-20140~74岁累积死亡率由1981年的1.94%下降到2014年的0.72%（APC=-2.7%,95%CI: -3.3%~-2.1%），结直肠癌死亡的风险在0~74岁年龄组逐渐降低。男性（APC=-2.4%,95%CI: -3.1%~-1.7%）与女性（APC=-3.1%,95%CI: -4.0%~-2.2%）人群中结直肠癌0~74岁累积死亡率也明显下降，见表 1。
2.2 江苏省昆山市1981—2014年结直肠癌年龄别死亡率分析
总的来看，昆山市1981—1992年这个时期结直肠癌死亡率较低，从45岁开始缓慢上升，男性与女性人群中上升的幅度基本一致，男性死亡率略高于女性，见表 2、图 2。1993—2004年间，结直肠癌死亡率45岁之前处于较低水平，而45岁之后则急剧上升，至70~74岁达到高峰，但75岁以上年龄组则明显回落，见表 2、图 2。2005—2014年间，结直肠癌死亡率在45岁之后则急剧上升，至85岁达到高峰，没有发现高年龄段有回落，见表 2，图 2。
表 2 江苏省昆山市1981—2014年结直肠癌年龄别死亡率（1/10万）Table 2 Age specific mortality of colorectal cancer in Kunshan, Jiangsu Province, 1981-2014 (per 100,000)
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图 2 江苏省昆山市1981—2014年结直肠癌年龄别死亡率Figure 2 Age specific mortality of colorectal cancer in Kunshan, Jiangsu Province, 1981-20143 讨论
本研究结果显示江苏省昆山市1981—2014年结直肠癌标化死亡率呈现明显的下降趋势（APC=-2.4%,95%CI: -2.9%~-1.9%）。昆山市2011年结直肠癌位居发病顺位第5位，是威胁居民健康的癌症之一[6]。
中国2010年和2011年结直肠癌中标率分为7.55/10万和7.77/10万；而同期城市人群中中标率分别为8.58/10万和9.01/10万[2, 10]；2011年昆山市结直肠癌中标率分别为7.48/10万和9.12/10万，与全国水平基本相当。江苏省2012年死因监测结果显示结直肠癌位居死因顺位第5位，标化死亡率为5.70/10万（昆山2012年标化率为6.51/10万）[11]。浙江省2000—2009年肿瘤登记地区报告的结直肠癌死亡率[中标率（1982）男女合计为5.57/10万，男性与女性分别为6.43和4.77/10万][12]与本研究结果基本一致。虽然昆山市结直肠癌死亡率略高于江苏省，但与全国水平基本相当；考虑到这仅仅是某个时点的横断面比较，探索其过去死亡率趋势则更能反映结直肠癌的流行水平。
本研究呈现了较长一段时间内江苏省昆山市结直肠癌死亡率的变化趋势，但是国内不同地区其变化趋势有较大差异。厦门地区2002—2009年结直肠癌标化死亡率（1982年）则呈现了明显上升趋势，由2002年的3.28/10万上升到2009年的5.51/10万[13]；此外辽宁省城市与农村居民结直肠癌死亡率在1973年和2005年两个时期也明显上升[14]。但是浙江省2000—2009年肿瘤登记地区报告的结直肠癌年龄标化死亡率未能发现明显变化趋势（APC=1.63%,95%CI: -0.20%~3.48%）[12]，与本研究结果一致。
本研究中男女性别之间死亡率下降趋势基本一致，结直肠癌死亡率性别差异不明显。陈忠龙等对厦门2002—2009年大肠癌死亡分析显示，在男女性别之间均明显上升，但是女性人群中上升幅度更为明显[15]。陈万青等对1989—2008年中国恶性肿瘤发病性别和城乡差异分析结果显示，恶性肿瘤发病的性别比由1989年的1.56下降到2008年的1.35，城乡比值由1989年的0.89上升到2008年的0.98[16]。在肿瘤发病性别差异缩小，城乡差距拉大的现象中包含的是致癌因素的变化。这间接提示昆山市结直肠癌的致癌因子在性别之间差异较小。
本研究结果显示，结直肠癌累积死亡率（0~74岁）由1981年的1.94%下降到2014年的0.72%（APC=-2.7%），0~74岁人群中结直肠癌死亡风险在随时间下降。1981—1992、1993—2004及2005—2014年三个时期结直肠癌的年龄别死亡率分析结果也进一步提示，结直肠癌年龄别死亡率随着时间向高年龄组迁移；同时2005—2014年间结直肠癌年龄别死亡率没有在高年龄组回落，与中国城市人口结直肠癌死亡率一致[2, 10]。该现象隐含了结直肠癌致癌因子随时间变化、以及结直肠癌治疗和预后等一系列影响结直肠癌疾病谱的因素。虽然昆山市在统计分类中属于农村地区，但是由于近20年的社会经济发展，使得居民生活方式更加接近城市。此外也与昆山市人口老龄化现象相吻合。昆山市平均期望寿命由1981年的69.67岁上升到2013年的81.87岁；60岁以上人口比例由1981年的8.2%上升到2014年的20.6%[5]。除了人口老龄化因素，诸如年龄[10]、肥胖（BMI）[17-18]、遗传易感性（家族史）[19]、炎症性肠炎[19]、生活方式和饮食模式[4, 17-18]、吸烟[19]、饮酒[20]等也与结直肠癌相关。另外，大肠癌的早诊早治是降低疾病预后的有效方法[21]，因此这也直接表现为结直肠癌手术者要比非手术者5年生存率明显提高[22]。虽然昆山市尚未开展结直肠癌早诊早治，但是在昆山地区初步评价结直肠癌流行病学特征的基础上，开展筛查无疑是我们努力的方向。
本研究也有几点缺陷：一是1981—2014年的结直肠癌死亡数据来源于死因监测年度报表，难以展开进一步的分析。二是本研究中不能呈现完整的质量控制指标，如漏报率和错误编码率等。虽然具有以上缺陷，但是我们也在加紧实施质量控制。2013年加入国家疾病监测点，2011—2012年开展了死亡漏报调查，结果显示漏报率为0.34%，提示近期的死因监测处于可接受区间[23]。昆山市于2006年全面开展肿瘤登记工作，2006年以后肿瘤登记与死因监测工作相互结合，可有效避免漏报及错分偏倚。
虽然昆山市1981—2014年结直肠癌死亡率呈现下降趋势；但是因结直肠癌死亡的例数明显上升，疾病负担加大。就此现象，一方面表现为昆山市结直肠癌死亡率历史水平较高，虽然因结直肠癌死亡数也在增加，但是年均观察人年数增加（人口）的幅度远大于死亡数，因此粗死亡率无明显变化，而年龄标化死亡率明显下降。另一方面也可能是昆山市结直肠癌的致癌因子逐渐弱化所致。Xu等在广东的病例对照研究显示，淡水鱼及海鱼的摄入与结直肠癌之间呈现明显的保护效应，且剂量反应关系明显[24]；昆山市居民也具备相似的饮食，但该保护效应在昆山是否成立，尚待进一步研究。
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