Construction and Screening of shRNA Expression Plasmids Targeting at cortactin Gene
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摘要: 目的 构建靶向cortactin基因的shRNA重组质粒，并筛选出沉默cortactin基因效果最明显的shRNA重组质粒。方法 设计并合成3对针对cortactin基因不同位点的shRNA片段，构建相应的重组质粒（命名为pBSilence1.1-cortactin-shRNA1-3），并进行酶切鉴定和测序分析。通过脂质体转染方法将各重组质粒及阴性对照质粒分别转染至人肝癌HepG2细胞中，转染24 h后荧光显微镜下观察各组细胞的转染情况，并采用RT-PCR检测各组细胞mRNA的表达情况。结果 构建的重组质粒经酶切鉴定与测序分析证实完全符合设计要求, 转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光，3组重组质粒组HepG2细胞的cortactin基因mRNA表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。与pBSilence1.1-cortactin-shRNA1和pBSilence1.1-cortactin-shRNA2两组相比，pBSilence1.1-cortactinshRNA3组的cortactin基因mRNA表达降低更加显著（P<0.05）。结论 成功构建并筛选的重组质粒能有效抑制HepG2细胞中cortactin基因mRNA表达，为下一步研究沉默cortactin基因对肝癌细胞生物学行为的影响提供了实验基础。Abstract: Objective To construct short hairpin RNA (shRNA) expression plasmids targeting at the cortactin gene, and to screen the plasmid with the most knockdown efficiency. Methods Three pairs of shRNAs targeting at the cortactin gene were designed and synthesized. The shRNA expression plasmids (named pBSilence1.1-cortactin-shRNA1-3) were constructed and identified using restriction enzyme analysis and sequence analysis. The plasmids (pBSilence1.1-cortactin-shRNA1-3 and negative control plasmid) were then transfected into HepG2 cells via liposome. The transfection results were observed after 24h, and the cortactin mRNA expression was measured by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR). Results The expression plasmids were confirmed by restriction enzyme analysis and sequence analysis. After the plasmid vector with green fluorescent protein was transfected to the cells, it was seen as a green fluorescent wave. RTPCR results showed that the cortactin mRNA expression in HepG2 cells of the three recombinant plasmids groups were decreased significantly compared with the negative control and blank control group(P＜0.05). The pBSilence1.1-cortactin-shRNA3 had the strongest knockdown efficiency compared with pBSilence1.1- cortactin-shRNA1 and pBSilence1.1-cortactin-shRNA2 groups(P＜0.05). Conclusion The constructed and screened shRNA expression plasmid targeting at the cortactin gene could suppress the cortactin mRNA expression in HepG2 cells significantly, which provides an experimental basis to study the effect of cortactin gene silencing on the biological behavior of liver cancer cells by RNA interference.
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Key words:
- Cortactin /
- Short hairpin RNA(shRNA) /
- RNA interference /
- Liver cancer
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0 引言
上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）的死亡率位居妇科恶性肿瘤中病死率的首位，由于其发病隐匿，大部分患者就诊时已处于中晚期，并且已向盆腹腔扩散和远处转移等，所以如何做到早期诊断是一大难题[1-2]。EOC的病因尚不清楚，大量研究证实其发生发展可能是多基因、多步骤、多阶段改变的过程[3-4]。近年来，有学者研究发现细胞内一些结构如细胞骨架的改变可能与细胞癌变密切相关[5-6]。胰岛素受体酪氨酸激酶底物p53蛋白（insulin receptor tyrosine kinase substrate p53, IRSp53）目前已被证实是一个控制细胞迁移能力的关键蛋白，可以启动恶性肿瘤侵袭过程中丝状伪足的形成，并对癌细胞的运动能力产生相应的影响[7-8]。基于此，本研究初步探讨IRSp53蛋白表达在EOC发生发展中的作用，旨在了解IRSp53蛋白表达的变化在EOC早期诊断和预后中的作用，为临床治疗EOC提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 标本收集
选择西宁市第一人民医院2008年1月至2010年12月76例经病理学专家进行组织学认定的手术存档ECO组织蜡块，均取自女性患者。标本制片后，分别进行免疫组织化学检测。EOC患者中位年龄为52（30~76）岁，组织病理分级参照国际妇产科协会（FIGO）联合国际妇科肿瘤协会（IGCS）共同制定的妇科恶性肿瘤分期标准（2000年）：Ⅰ期13例，Ⅱ期18例，Ⅲ期39例，Ⅳ期6例；组织病理分级参照WHO肿瘤组织学分类标准（1999年）：G1级20例，G2级25例，G3级31例；病理学类型：浆液型47例，黏液型20例，透明细胞型9例；淋巴结转移25例，无淋巴结转移51例。所有病例均有完整的病理资料，并且EOC患者均为初发，术前均未接受过放化疗治疗。本研究征得所有研究对象的知情同意和本院伦理委员会批准，实验过程严格按照国家伦理学审查机构和协议进行。
1.2 主要试剂
鼠抗人IRSp53单克隆抗体（ab106775）购自英国Abcam公司，抗体稀释液、免疫组织化学二抗试剂盒和浓缩型DAB试剂盒均购自美国Santa Cruz公司。
1.3 免疫组织化学方法
存档蜡块制成厚4 μm的连续病理切片，以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照，抗原修复采用EDTA（pH9.0）抗原修复液高压锅热修复。鼠抗人IRSp53单克隆抗体的工作浓度为1:200，置于4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗2次，滴加二抗后室温孵育30 min，DAB显色，苏木精对比染色，脱水、透明、封固。
1.4 阳性结果判断
IRSp53阳性表达判定：以细胞质呈现棕黄色及棕褐色颗粒者为阳性细胞，测定时采用双盲法，由两名经验丰富的病理科医生在200倍光学显微镜下随机选择5个视野进行半定量计数[6]。根据染色强度，无色积分为0分，浅黄色积分为1分，棕黄色积分为2分，棕褐色积分为3分；阳性细胞数比例 < 25%为0分，25%~50%为1分，50%~75%为2分，> 75%为3分。将每张切片的染色强度评分和阳性细胞比例评分相乘，乘积0~1为（-），2~3分为（+），4~6分为（++），7~9分（+++），最后将（++）和（+++）为高表达组，（-）和（+）为低表达组。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0软件，计量资料以（x±s）表示，进行t检验和Mann-Whitney U非参数检验；计数资料采用χ2检验，生存曲线采用Kaplan-Meier法进行评估，IRSp53不同程度表达与病理分级之间关系采用Wilcoxon秩和检验，线性相关性研究采用Spearman相关分析法，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IRSp53在EOC中的表达
免疫组织化学法检测结果显示，IRSp53蛋白主要表达于胞膜和胞质中，在细胞核中基本无表达，呈棕黄色颗粒，见图 1。
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图 1 IRSp53在EOC组织中的表达 (×200)Figure 1 The expression of IRSp53 in EOC tissues (×200)A: negative expression of IRSp53 in EOC tissues; B: high expression of IRSp53 in serous EOC tissues; C: low expression of IRSp53 in serous EOC tissues; D: positive expression of IRSp53 in mucinous EOC tissues; E: positive expression of IRSp53 in transparent cells EOC; EOC: epithelial ovarian cancer2.2 IRSp53在EOC组织中的表达水平与患者临床关系
76例EOC组织中，IRSp53蛋白的表达与FIGO分期（Z=-3.526, P=0.000）、组织病理分级（Z=-2.471, P=0.013）、病理学类型（Z=-2.305, P=0.029）、淋巴结转移（Z=1.124, P=0.008）和CA125水平（Z=1.462, P=0.000）显著相关，见表 1。
表 1 IRSp53在EOC组织中的表达与临床病理特征关系Table 1 Relationship between IRSp53 and clinical characteristics in EOC
2.3 EOC组织中IRSp53表达与病理分级关系
Wilcoxon秩和检验结果显示，与G1级相比，G2、G3级EOC组织中IRSp53蛋白表达强度显著升高（P < 0.05）；与G2级相比，G3级EOC组织中IRSp53蛋白表达强度显著升高（P < 0.05）。Spearman相关分析结果显示，IRSp53的表达强度与组织病理分级之间呈显著正相关性（r=0.779, P < 0.05），见表 2。
表 2 IRSp53在EOC组织中的表达及其与病理分级的关系 (n=76)Table 2 Relationship between IRSp53 and pathological grading in EOC (n=76)
2.4 IRSp53表达与EOC患者预后的关系
45例IRSp53蛋白高水平表达患者的术后5年累积生存率为23.8%，31例IRSp53蛋白低水平表达患者的术后5年累积生存率为57.5%。经Log rank检验，IRSp53蛋白低水平表达患者的5年累积生存率显著高于IRSp53蛋白高水平表达者（χ2=5.018, P=0.016），见图 2。
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图 2 IRSp53蛋白表达水平与EOC患者预后关系Figure 2 Relationship between IRSp53 expression and prognosis of EOC patients3 讨论
EOC是卵巢癌最常见的类型，晚期患者5年生存率仅为20%~25%[9-10]。目前，肿瘤细胞减灭术、联合药物化疗及靶向治疗是临床治疗EOC的主要方案，但仍有75%的患者经治疗后复发[11]。因此，寻找能够早期诊断并有效预测患者预后的、特异性强、灵敏度高的分子标志物，对改善EOC患者的预后及提高生存率具有重要的临床意义。近年来研究发现，恶性肿瘤的侵袭转移与伪足的形成和细胞骨架重排密切相关，预防这些触须状结构的伪足形成，能阻止癌症扩散[12]。通过探寻调控EOC伪足形成的关键蛋白，能够为早期有效诊断EOC并改善患者的预后提供潜在的可能。
IRSp53属于I-BAR结构域蛋白家族，是一个控制细胞迁移能力的关键蛋白，介导伪足的形成并参与细胞骨架重排，在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用[13]。IRSp53主要含有I-BAR、CRIB、SH3及WH2四个结构域，其中I-BAR能够与细胞膜结合产生负向的向外的膜突起，促进伪足的形成。最新研究发现CRIB、SH3及WH2共同参与调节肌动蛋白，并与小GTP酶发生相互作用，参与丝状伪足和板状伪足的形成。Chen等[14]发现SOS1/Rac1-IRSp53-ABI1信号通路存在于卵巢癌患者的腹水中并有效地促进细胞迁移；Kast等[15]研究发现正常人类IRSp53处于封闭的非活动构象，肿瘤促进因子Eps8绑定到SH3域能协同IRSp53开放；Oikawa等[16]研究发现IRSp53蛋白含有I-BAR结构域，其将膜变形成突起并结合到Rac，CRIB基序与Cdc42相互作用，能促进卵巢癌细胞伪足的形成且支持细胞的迁移。因此，IRSp53可能作为早期诊断卵巢癌和评估卵巢癌预后的分子标志。
本研究检测IRSp53在EOC中的表达并分析其与EOC患者临床病理特征及预后的关系，结果显示IRSp53蛋白的表达与EOC的FIGO分期、组织病理分级、病理学类型、淋巴结转移和CA125水平关系密切，其中IRSp53在FIGO分期Ⅳ期高分化癌、浆液性、淋巴结转移和CA125水平大于500的EOC组织中呈现高表达。同时相关性分析显示IRSp53的表达强度与病理分级之间呈显著正相关性，生存曲线分析发现IRSp53高水平表达患者的5年累积生存率显著低于低水平表达患者，提示IRSp53高表达患者的预后更差。据此，我们认为IRSp53可能是EOC发生发展过程中的关键调控因子，其表达异常是导致EOC患者病情恶化的一个早期事件，同时也是部分EOC患者的组织病理分级由低分数向高分数发展的一个分子转变过程。
综上所述，IRSp53可能是EOC发生发展过程中的关键调控因子，其过度表达导致患者的预后更差。因此，IRSp53在EOC中可能发挥重要作用，可能成为未来治疗EOC的新靶点。
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