Serum Peptidome Patterns of Colorectal Cancer Based on Magnetic Bead Separation and Mass-spectrometry Technique
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摘要: 目的 应用磁珠联合质谱技术筛选结直肠癌Ⅰ、Ⅱ期患者差异蛋白质，建立其血清学筛查方法。方法 收集血清样本156例（其中结直肠癌80例，健康志愿者76例），随机分为建模组和验证组。采用弱阳离子磁珠分离血清小分子蛋白，基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱仪建立结直肠癌及健康志愿者血清蛋白谱，Clinprot Tools 2.2软件对建模组血清蛋白谱进行定量分析，建立结直肠癌判别模型，以所获取的判别模型判别验证组样本，评价判别模型的诊断价值。应用ELISA法检测验证组癌胚抗原。结果 对比分析建模组结直肠癌及健康志愿者血清蛋白谱，发现共有44个差异蛋白峰（P<0.05），其中在结直肠癌中高表达35个，低表达9个，利用其中3个差异峰（质荷比分别为1330.95、2883.96、9294.14）建立诊断模型，交叉验证的准确性为94.87%（74/78），经独立样本双盲验证，其敏感度为87.50%（35/40），特异性为89.47%（34/38），高于CEA。结论 应用磁珠分离和质谱技术建立的诊断模型具有较高的准确性，对提高结直肠癌的筛查具有一定的临床意义。
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关键词:
- 结直肠癌 /
- 蛋白组学 /
- 筛查 /
- 磁珠 /
- 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术
Abstract: Objective To establish a proteomic pattern for colorectal cancer(CRC) screening by comparing serum proteomic spectra between CRCs and healthy individuals. Methods Serum samples were collected from 80 CRCs and 78 healthy volunteers, and randomly divided into model construction group and validation group. The weak cation exchange(WCX) beads combined matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS) technique were used to detect the mass spectrometry data. The obtained mass spectrometry data were then analyzed using Clinprot Tools 2.2 software. A model identifying CRC from healthy volunteers was built in the model construction group and evaluated in the model validation group for reliability. Serum CEA from validation group was detected using ELISA kit as a control. Results Forty-four differentially expressed proteins in serum(P<0.05), including 35 up-regulated proteins and 9 down-regulated proteins, were screened by comparing serum protemic spectra between CRCs and healthy volunteers. Three proteins at m/z 1330.95, 2883.96 and 9294.14 were obtained for developing a Clinprot model which could identify CRCs from healthy volunteers with an accuracy of 94.87%(74/78). In a double blind validation, the Clinprot model yielded a sensitivity of 87.50% and a specificity of 89.47%, which surpassed to CEA. Conclusion Clinprot model constructed using MALDI-TOF-MS combined with WCX kit technology allows identifying CRCs from healthy volunteers with high accuracy, which may contribute to the screening of CRCs. -
0 引言
分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1）是Wnt通路的拮抗剂，是新发现的抑癌基因，SFRP1基因的表观遗传修饰与恶性肿瘤的发生、发展有关。国内有关SFRP1基因甲基化及其蛋白在肺腺癌中表达的报道甚少，本实验通过检测肺腺癌组织和癌旁组织中SFRP1基因甲基化及其蛋白的表达，探讨两者与肺腺癌的相关性，为肺腺癌的诊断与治疗提供基础。
1 资料与方法
1.1 研究资料
收集中国人民解放军武汉总医院2015年5月至2016年5月手术切除的肺腺癌标本60例和相应癌旁组织30例，每例标本各两份。一份标本经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，每块5 µm厚连续切片5张；另一份标本离体30 min内取材，置于-80℃低温冰箱保存。肺腺癌患者临床资料完整，男37例、女23例，年龄41~76岁，中位年龄61岁。按2009年国际肺癌研究协会（IASLC）修订的肺癌TNM临床分期标准：Ⅰ+Ⅱ期40例、Ⅲ期20例；中高分化34例、低分化26例；无淋巴结转移39例、有淋巴结转移21例。所有病例术前均未行放化疗，均经常规病理确诊。
1.2 甲基化特异性PCR法检测甲基化状态
提取标本中基因组DNA，按照试剂说明书，重亚硫酸盐DNA甲基化；SFRP1基因甲基化引物对设计见表 1，修饰后的DNA作为模板进行PCR扩增。2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，JY02S紫外分析系统扫描。
表 1 SFRP1基因甲基化和非甲基化引物序列Table 1 Primer of SFRP1 gene methylation and unmethylation
1.3 实时荧光定量PCR法检测mRNA的表达
（1）TRIzol法提取RNA；（2）反转录成cDNA反应条件：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 10 min；（3）半定量RT-PCR检测；（4）实时荧光定量PCR检测。绘制溶解曲线，最终数据以2-ΔΔCt进行分析。
1.4 免疫组织化学法检测蛋白的表达
石蜡切片常规脱水，免疫组织化学采用SP法，检查SFRP1蛋白的表达，用PBS代替一抗作空白对照。采用IPP6.0软件进行图像分析，测定平均SFRP1蛋白浓度。免疫组织化学结果判定：SFRP1蛋白阳性反应定位于细胞膜和细胞质，呈棕黄色颗粒。阳性染色主要为胞质出现棕黄色颗粒。高倍镜下每张切片取5个不同视野，按阳性细胞所占的百分率分为：阳性细胞数 < 10%为阴性表达，≥10%为阳性表达。
1.5 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示。计量资料行独立样本t检验；SFRP1在各组间表达率的比较采用χ2检验或Fisher’s精确检验；分析SFRP1基因甲基化与其蛋白表达之间的相关关系采用Spearman相关分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SFRP1基因甲基化情况
60例肺腺癌组织中35例SFRP1基因甲基化阳性，甲基化率为58.3%；30例癌旁组织中6例SFRP1基因甲基化阳性，甲基化率20.0%，两组差异有统计学意义（χ2=11.849, P=0.001），见图 1。SFRP1基因甲基化与肺腺癌细胞分化程度及淋巴结转移有明显的相关性，见表 2。
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图 1 SFRP1基因甲基化在肺腺癌和癌旁组织中的表达情况Figure 1 Expression of SFRP1 gene methylation in lung adenocarcinoma tissues and adjacent tissues0: marker; M: methylation; U: unmethylation; 1-4: lung adenocarcinoma tissues; 5-8: adjacent tissues表 2 SFRP1基因甲基化及其蛋白表达与肺腺癌患者临床及病理特点的关系Table 2 Relationship of SFRP1 gene methylation and SFRP1 protein with clinicopathological characteristics of lung adenocarcinoma patients
2.2 SFRP1蛋白在肺腺癌及癌旁组织的表达
SFRP1蛋白在肺腺癌及癌旁组织中的表达，见图 2，阳性表达率分别为38.3%（23/60）和83.3%（25/30），差异有统计学意义（χ2=16.272, P < 0.001）。SFRP1蛋白表达与肺腺癌细胞分化程度、临床分期及淋巴结转移情况有明显相关性，见表 2。
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图 2 肺腺癌组织及癌旁组织中SFRP1蛋白的阳性表达 (SP ×400)Figure 2 Positive expression of SFRP1 protein in lung adenocarcinoma tissues and adjacent tissues (SP ×400)A: lung adenocarcinoma tissues; B: adjacent tissues2.3 SFRP1 mRNA在肺腺癌及癌旁组织的表达
肺腺癌及癌旁组织中SFRP1 mRNA均有阳性表达，其相对表达量分别为（0.847±0.297）和（2.019±0.445），见图 3，SFRP1 mRNA在肺腺癌组织中的表达低于癌旁组织（t=-4.386, P < 0.01）。
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图 3 SFRP1 mRNA在肺腺癌和癌旁组织中的表达情况Figure 3 Expression of SFRP1 mRNA in lung adenocarcinoma tissues and adjacent tissues2.4 SFRP1基因甲基化与其蛋白表达的相关性分析
60例肺腺癌组织标本，35例SFRP1基因甲基化阳性表达中有30例SFRP1蛋白表达缺失；25例SFRP1基因甲基化阴性表达中有7例SFRP1蛋白表达缺失。SFRP1基因甲基化与其蛋白表达缺失存在相关性（r=-0.585, P < 0.001）。
3 讨论
Wnt信号通路是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路，对细胞增殖、分化和凋亡有重要影响[1]。Wnt信号通路的异常激活与多种已知的高发性癌变密切相关，如乳腺癌、胃癌等[2]。SFRP1基因是Wnt信号通路“门户”基因，是一种新发现的抑癌基因[3]，定位于人染色体8p12-p11.1。SFRP1基因甲基化能够导致基因沉默，对Wnt信号通路抑制作用减弱，促进肿瘤发生和发展。在乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肾癌等[4-8]多种恶性肿瘤细胞中，SFRP1基因启动子区域的CpG岛出现了甲基化。
本实验采用甲基化特异性PCR法检测60例肺腺癌和30例癌旁组织标本的SFRP1基因甲基化情况，结果显示肺腺癌组织中SFRP1基因甲基化率显著高于癌旁组织（P=0.001）。Licchesi等[9]在肺腺癌细胞系中发现SFRP1基因出现甲基化，并且SFRP1基因沉默发生于腺癌形成的早期阶段，在肺组织非典型腺瘤样增生发展为肺腺癌过程中起重要作用。Fang等[10]研究发现非小细胞肺癌组织中SFRP1基因甲基化高于癌旁组织，SFRP1基因甲基化与非小细胞肺癌的组织分化程度和有无淋巴结转移有关。本实验得出SFRP1基因甲基化与患者的组织分化程度和淋巴结转移相关，提示SFRP1基因启动子发生甲基化可能发生在肺腺癌形成的早期。实时荧光定量PCR检测表明肺腺癌组织中的SFRP1 mRNA相对表达量显著低于癌旁组织（P < 0.01），可能与SFRP1基因启动子发生甲基化有关。SFRP1蛋白在肺腺癌组织的阳性表达率显著低于癌旁组织（P < 0.001），与肺腺癌细胞分化程度、临床分期及淋巴结转移情况明显相关。本实验结果与Fang等[10]研究基本相符，不同的是本实验设计与其相比还具有以下两方面优势：（1）实验标本的选择。大量关于Wnt信号通路中相关蛋白（如E-cadherin、β-catenin等）的表达及与临床病理资料关系的研究结果不尽相同，如Bremnes等[11]认为E-cadherin低表达与非小细胞肺癌的肿瘤细胞分化、淋巴结转移情况及患者预后差有关，而Pirinen等[12]研究未发现其相关性。其主要原因之一是研究者将非小细胞肺癌作为整体，而Wnt信号通路中相关蛋白在非小细胞肺癌不同组织学类型中的表达量是有差异的。本实验选取肺腺癌组织标本作为研究对象，一是肺腺癌是非小细胞肺癌的主要病理亚型，二是体外实验研究[9]显示SFRP1基因甲基化与肺腺癌的形成密切相关。（2）实时荧光定量PCR和IPP6.0图像分析技术分别对SFRP1基因及其蛋白进行定量检测，实验结果更具有客观性。Taguchi等[13]对非小细胞肺癌细胞系研究发现逆转SFRP1基因甲基化可以使SFRP1 mRNA表达增多，抑制Wnt信号通路的异常激活。我们通过对SFRP1基因甲基化与其蛋白表达的相关分析发现，SFRP1基因甲基化与SFRP1蛋白表达缺失密切相关（r=-0.585, P < 0.001），推测SFRP1蛋白表达降低可能是SFRP1基因发生甲基化所致。SFRP1蛋白表达降低，对Wnt信号通路抑制作用减弱，从而促进肺腺癌的发生。
综上所述，肺腺癌组织中Wnt信号通路的抑制因子SFRP1基因出现甲基化，SFRP1蛋白表达降低，Wnt信号通路异常激活，其下游靶基因状态发生改变。可以看出SFRP1基因甲基化与肺腺癌发生、发展密切相关，可能为肺腺癌的表观遗传干预治疗提供理论基础。然而，目前尚缺乏肺腺癌中SFRP1蛋白与Wnt信号通路下游相关蛋白表达相互关系的报道，需要实验研究进一步分析。
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