Impact of C-terminal Binding Protein 1 on Cell Proliferation of Hepatocellular Carcinoma Cell HepG2
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摘要: 目的 研究羧基末端结合蛋白1（C-terminal binding protein1,CtBP1）对人肝癌细胞HepG2增殖的影响及机制。 方法 采用CtBP1 siRNA转染HepG2细胞，实验分为4个组：空白对照组、转染试剂对照组、阴性序列对照组与干扰组。于转染后不同的时间收集细胞，用MTT法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况。结果 CtBP1 siRNA转染有效抑制了HepG2细胞中CtBP1蛋白表达，与空白对照组比较，转染后72 h后，CtBP1蛋白下调了57.80%。 CtBP1沉默后细胞生长受到抑制（P＜0.05），转染后24、48、72、96 h生长抑制率分别为22.34%、52.15%、53.97%和54.77%；而对细胞周期分布无明显影响（P＞0.05）；但CtBP1表达下调有促凋亡作用，与对照组相比，干扰组的细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。结论 CtBP1沉默能抑制HepG2细胞增殖，其机制是通过促凋亡来实现的。CtBP1能促进肿瘤生长和抑制凋亡，是潜在的肿瘤治疗靶点。Abstract: Obiective To investigate the impaction of C-terminal binding protein 1 (CtBP1) on proliferation of hepatocellular carcinoma cell HepG2 and related mechanism. Methods siRNA targeting for CtBP1 were introduced into HepG2 cells to knock down CtBP1,3 control groups including blank control, transfection reagent and control siRNA were used as controls.At different time points after transfection, HepG2 cells were collected for MMT assay to detect cell proliferation and fl owcytometry to detect cell cycle distribution and apoptosis. Results CtBP1 siRNA effectively knocked down CtBP1 in HepG2 cell. Compared with control group, CtBP1 protein signifi cantly was decreased by 57.80%.Cell growth were signifi cantly inhibited after CtBP1 knockdown (P＜0.05). The inhibition rates of cell growth were 22.34%,52.15%,53.97% and 54.77% at 24, 48, 72 and 96 h respectively. The distribution of cell cycle was not changed but apopotic cells were increased significantly compared with control group. Conclusion CtBP1 knockdown could inhibit cell proliferation of HepG2 mainly through apoptosis instead of cell cycle arrest. CtBP1 is involved in cell growth and apoptosis inhibition of tumor cells, and could be a candidate for cancer targeted therapy.
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0 引言
ⅢA-N2期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是备受关注和争议的一组疾病，即使经过完全切除手术及辅助化疗，其局部复发率仍可高达40%[1-4]。随着现代放疗技术的发展，局部放疗的不良反应较前明显减小，但ⅢA-N2期NSCLC完全切除术后辅助放疗的作用仍存在较大争议。本文回顾性分析了ⅢA-N2期NSCLC完全切除术后化疗再放疗与未再放疗患者的生存情况，观察术后放疗的作用及获益人群。
1 资料与方法
1.1 病例资料
自2010年1月至2014年12月于河北医科大学第四医院行手术治疗的ⅢA-N2期NSCLC患者共440例。本研究纳入标准：（1）手术：为可切除NSCLC，行肺癌根治性手术（肺叶切除或全肺切除+纵膈淋巴结清扫术），R0切除，N1及N2站淋巴结清扫站数均≥3站，术后病理为NSCLC，术后病理分期为ⅢA-N2期（按照2009年发布的第七版支气管肺癌TNM分期[5]）。（2）化疗：行2周期及以上以铂类为基础的全身辅助化疗。（3）放疗：术后应用6-MV X线行三维适形或调强预防性胸部照射，CTV靶区范围包括手术残端、患侧肺门、受侵淋巴结区域，PTV为CTV外扩0.5 cm，放疗剂量为每日1次，每次2 Gy，5次/周，中位照射剂量为50 Gy（45~54 Gy）。正常组织受量限制：脊髓≤40 Gy，双肺V20≤28%，双肺V30≤18%，心脏V30≤40%，V40≤30%。排除标准：（1）非R0切除；N1或N2淋巴结清扫站数不足3站。（2）行新辅助化疗。（3）术前行胸部放疗。（4）术前已出现远处转移。（5）存在第二原发肿瘤。
1.2 研究方法
入组患者共313例，基本情况见表 1，行术后放疗患者人数较少（仅23例）。为减小选择偏倚，提高研究结果准确性，我们将入组患者采用倾向评分匹配法（propensity score matching,PSM）进行匹配，协变量包括性别、年龄、肿瘤部位、是否术前N2、病理类型、T分期、术式、隆突下淋巴结是否阳性、肿瘤最大径、N2阳性淋巴结个数、N2阳性淋巴结站数以及是否跳跃转移，应用最邻匹配法将术后放疗组和未放疗组患者按1:4进行匹配，对比匹配前后两组间协变量的分布情况。回顾性分析匹配成功患者的病历资料，比较术后放疗组及未放疗组患者生存率、局部控制率、无远转率及无进展率，观察相关临床及病理因素对局控的影响，分析术后放疗作用及获益人群。
表 1 313例ⅢA-N2期非小细胞肺癌患者基本资料Table 1 Clinical characteristics of 313 patients
1.3 观察指标
总生存时间（overall survival,OS）定义为从首治之日开始至患者死亡时间或末次随访日。局部控制时间，即无局部区域复发时间（local-regional failure free survival,LRFFS）定义为从手术之日至患者出现手术残端复发和（或）纵膈淋巴结区域复发的时间。无远处转移时间（distant metastasis free survival,DMFS）定义为从患者手术之日至出现远处转移的时间。无进展生存时间（progression-free survival,PFS）定义为从手术之日开始至第一次发生疾病进展或死亡的时间。根据RTOG放射性损伤分级标准评价术后放疗组患者放射性肺炎、放射性食管炎等不良反应。
1.4 随访与统计学方法
随访时间为手术结束至末次随访或死亡时间。随访方式有门诊复查、再次入院、电话、信访等。随访终止日期为2015年11月5日。统计学分析采用SPSS软件、R2.8.1软件包。应用Kaplan-Meier法计算比较生存率、局部控制率、无远处转移率及无进展生存率，应用Log rank检验分析各变量与预后的关系，应用t检验或χ2检验进行组间分布比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 匹配前后资料及配比后失败分析
经倾向评分匹配后共103例患者匹配成功，其中术后放疗即PORT（+）组22例，未放疗即PORT（-）组81例，中位随访时间为38.8月，匹配前后基本资料，见表 2。两组患者死亡、局部复发和（或）远处转移例数以及占各组总例数的比例，见表 3。
表 2 倾向评分匹配前后基本资料Table 2 Comparison of characteristics before and after propensity score matching
表 3 配比后103例患者失败情况Table 3 The 103 failure cases after matching
2.2 术后PORT（-）组与PORT（+）组生存比较
PORT（-）组与PORT（+）组1、3、5年生存率分别为92.5%、52.1%、40.6%与95.5%、76.5%、58.3%（P=0.162），见图 1。PORT（-）组与PORT（+）组1、3、5年局控率分别为83.3%、56.5%、42.4%与95.5%、82.9%、73.7%（P=0.036），见图 2。PORT（-）组与PORT（+）组1、3、5年无远处转移率分别为79.3%、54.9%、54.9%与86.4%、80.6%、80.6%（P=0.116），见图 3。PORT（-）组与PORT（+）组1、3、5年无进展率分别为70.6%、39.5%、29.6%与86.4%、74.8%、65.5%（P=0.021），见图 4。
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图 2 PORT(+)组与PORT(-)组的局控曲线Figure 2 Kaplan-Meier curves for local-regional failure free survival (LRFFS) of PORT(+) and PORT(-)![]()
图 3 PORT(+)组与PORT(-)组的无远处转移生存曲线Figure 3 Kaplan-Meier curves for distant metastasis free surival (DMFS) of PORT(+) and PORT(-)![]()
图 4 PORT(+)组与PORT(-)组的无进展生存曲线Figure 4 Kaplan-Meier curves for PFS of PORT(+) and PORT(-)2.3 术后PORT（-）组与PORT（+）组生存率、局部控制率的分层分析
2.3.1 生存分析
隆突下阳性淋巴结患者PORT（-）组与PORT（+）组3年生存率分别为32.7%、72.9%（P=0.026）；隆突下阴性淋巴结患者PORT（-）组与PORT（+）组3年生存率分别为67.0%、68.4%（P=0.565）。术前N2患者PORT（+）组与PORT（+）组3年生存率分别为31.8%、100%（P=0.014）；非术前N2患者PORT（-）组与PORT（+）组3年生存率分别为55.0%、45.7%（P=0.448）。对病理类型、阳性N2淋巴结个数与站数、肿瘤最大径及是否跳跃转移的分层分析中，生存率差异均无统计学意义。
2.3.2 局部控制率分析
术后PORT（-）组与PORT（+）组局部控制率的分层分析，见表 4。亚组分析中，隆突下淋巴结阳性、多站N2阳性淋巴结、肿瘤最大径>3 cm及非跳跃转移患者的局部控制率PORT（+）组高于与 PORT（-）组，P值分别为0.011、0.038、0.046和0.034。
表 4 PORT(+)组与PORT(-)组局控的分层分析Table 4 Hierarchical analysis for LRFFS of PORT(+) and PORT(-)
2.4 放疗不良反应
随访期内，术后放疗组共22例ⅢA-N2期NSCLC患者中，仅有1例发生2级放射性肺炎（4.5%），2例发生Ⅱ度及以下骨髓抑制（9.1%），未发现放射性食管炎及放射性心包炎，未发现3级或4级放射性损伤。
3 讨论
近年来许多文献报道了术后放疗可提高ⅢA-N2期NSCLC患者总生存。Zou等通过多中心回顾性分析了ⅢA-N2期NSCLC完全切除术后放疗的作用，结果显示术后放疗提高了ⅢA-N2期NSCLC患者5年生存率（P=0.007）[6]。Robinson等研究报道了pN2期NSCLC完全切除术后放化疗组与术后单纯化疗组5年生存率分别为39.3%与34.8%（P=0.014）[7]。Lally等发现术后放疗可使pN2期NSCLC术后5年生存率提高7%（P=0.008）[8]。Feng等报道了ⅢA-N2期NSCLC术后预防性胸部照射可得到明显的生存获益[9]。
Dai等报道了ⅢA-N2期NSCLC完全切除后辅助放疗组与未辅助放疗组的5年局部控制率分别为63.9%、46.7%（P=0.025）[10]。刘翼等报道术后辅助放疗可降低ⅢA-N2期NSCLC术后化疗后局部复发风险（P=0.001）[11]。Kim等应用PSM评价ⅢA-N2期NSCLC术后放疗的作用，结果发现术后放疗显著提高了ⅢA-N2期NSCLC的局部控制率，而未延长总生存期[12]，本研究中术后放疗组局部控制率优于未放疗组，与上述文献结果相近。
目前，一些学者研究术后放疗在ⅢA-N2期NSCLC各因素亚组中的作用，观察获益人群。其中，Matsuguma等报道应用现代放疗技术可提高多站转移的ⅢA-N2期NSCLC的5年无病生存率，降低局部复发风险[13]。Sawyer等认为N2多站转移是ⅢA-N2期NSCLC术后复发的高级风险因素，T3、T4是ⅢA-N2期NSCLC术后复发的中级风险因素，均可获益于术后胸部放疗[14]。杜芳芳等研究发现多站转移的pN2期NSCLC患者中放疗组与未放疗组5年生存率和5年局部控制率分别为36%、20%（P=0.013）和65%、48%（P=0.006）；肿瘤最大直径>3cm的患者中放疗组与未放疗组5年生存率和5年局部控制率分别为33%、15%（P=0.002）和62%、48%（P=0.033）[15]。Saito等报道了肿瘤直径>2 cm的pN2期NSCLC的5年生存率远低于≤2cm的患者[16]。本研究结果亦发现多站转移、肿瘤最大直径≥3cm亚组可获益于术后放疗，使复发风险降低。
对于隆突下淋巴结阳性的亚组，Aokage等发现对比隆突下淋巴结阴性的NSCLC，隆突下淋巴结阳性者更易出现复发，且5年生存率较低[17]。刘敬伟等研究报道存在隆突下淋巴结转移的ⅢA-N2期NSCLC术后复发风险是未转移者的2.11倍（P=0.026）[18]。在本研究中，隆突下淋巴结阳性的ⅢA-N2期NSCLC行术后化疗再辅以放疗可提高生存率，降低复发风险。鉴于隆突下淋巴结转移者可能导致复发高预后差的特点，我们建议术后放疗应引起足够重视。目前许多研究报道pN2期NSCLC中淋巴结跳跃转移者预后优于无跳跃转移者，生存率较高，但具体机制尚不明确[19-22]。有学者认为跳跃转移组的淋巴结转移总个数往往低于非跳跃组，在淋巴引流中肿瘤负荷较小，因此可致较好的生存和较低的复发[23]。此外，Kim等报道术后放疗提高了ⅢA-N2期NSCLC中鳞癌亚组的5年局部控制率[12]，靳国华等也有相似的报道[24]。在本研究结果中，鳞癌亚组术后放疗者3、5年局部控制率均高于未术后放疗者，差异接近统计学意义（P=0.055）。
综上分析，术后放疗可提高ⅢA-N2期NSCLC术后化疗后局部控制率及无进展生存率；亚组分析中隆突下淋巴结转移、肿瘤最大径≥3 cm、多站转移、非跳跃转移及术前N2者获益较大。我们建议ⅢA-N2期NSCLC术后化疗后行预防性胸部放疗，尤其是受益较大的亚组。但本文是回顾性研究，术后放疗人数仅22例，尤其是分层分析中各层例数均较少，代表性可能较差，虽然整体匹配后两组差异明显减小，基线水平基本一致，但匹配后标准化均数差（SMD）还有三项大于0.1，匹配并非较高水平。因此，ⅢA-N2期NSCLC术后放疗的作用及获益人群仍需大样本前瞻性研究做进一步分析及验证。
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