原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之 一，其发生发展过程涉及到癌基因、肿瘤抑制基 因、凋亡调节基因和DNA修复调节基因等多种基 因的异常。羧基末端结合蛋白（C-terminal binding protein 1，CtBP1）是一个癌基因，CtBP能作为转 录辅抑制因子抑制多个肿瘤抑制基因的转录，并 且与肿瘤的生物学行为密切相关^{[ 1 ]}。我们前期研究 发现肝细胞肝癌组织中CtBP1表达上调；肝细胞肝 癌组织中其表达与肿瘤的分级相关^{[ 2 ]}。为进一步阐 明CtBP1在肝细胞肝癌中的作用及机制，本研究通 过RNAi技术抑制HepG2细胞中CtBP1的表达，观 察CtBP1表达下调对细胞增殖、细胞周期与凋亡的 影响，为肝细胞肝癌发生发展的机制提供理论和 实验基础。 1 材料与方法 1.1 材料

高糖型DMEM培养液购自Hyclone公司， control siRNA-A、CtBP1 siRNA(h)、CtBP(C-1) 均购自Santa Cruz公司，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent购自Roche公司，Opti-MEM-I Medium购自Gibco公司，MTT购自Sigma公司， DMSO购自Amresco公司。 1.2 细胞株及其体外培养

人肝癌细胞株HepG2由桂林医学院科学实验 中心保存，用含10%胎牛血清及1%的青霉素和1% 链霉素的高糖型DMEM培养液培养于37℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中。 1.3 CtBP1 siRNA转染

对数生长期的HepG2细胞接种于6孔细胞培养 板或96孔培养板中，培养过夜至细胞融合度约70% 时转染，设空白对照组、转染试剂对照组、阴性 序列对照组和干扰组，每组设重复3孔。简述如 下：细胞1×10⁵/ml接种于培养板中（六孔板2 ml， 96孔板100 μl）；无抗生素DMEM培养液中培养过 夜至细胞融合度约70%时，转染细胞，siRNA的最 终浓度为20 pmol/ml（六孔板加入总体积100 μl的 siRNA-转染试剂混合物，96孔板15 μl）；转染8 h 后换成完全培养液，培养至相应的时间用于后续 相关指标检测。 1.4 Western blot检测CtBP1的表达

转染后72 h收集细胞，加入含有PMSF及蛋白 酶抑制剂的RIPA裂解液，充分裂解后，4℃下12000 r/min离心30 min，取上清液即为蛋白样品。BCA 蛋白浓度测定法对蛋白样品进行定量。取30 μg 总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜 法转膜，室温条件下用牛奶封闭液封闭1h，一抗 CtBP(C-1)（用含5%脱脂奶粉的TBST配制）4℃ 孵育过夜，洗膜，二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG （H＋L）（用含5%脱脂奶粉的TBST配制）室温 孵育1 h，洗膜，发光、暴光、显影、定影，对X 光胶片扫描记录，测定各条带灰度值，蛋白相对 表达量＝目的蛋白条带灰度值/内参照蛋白条带灰 度值。蛋白表达抑制率（%）＝（1－干扰组相对 表达量/空白对照组相对表达量）×100%。 1.5 MTT法检测转染后HepG2细胞的增殖情况

细胞接种于96孔板中，分组及转染方法同1.3， 每组设6个复孔。分别于转染24、48、72、96 h 后，弃去培养液，PBS缓冲液冲洗2次，每孔加入 0.5%MTT溶液，置细胞培养箱中培养4 h后取出， 弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，低速振荡10 min，待结晶物充分溶解后，酶标仪上于490 nm波 长处测量各孔的吸光度值（OD值），并以时间为 横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，按 生长抑制率＝（1－实验组平均OD值/空白对照组平 均OD值）×100%计算转染后细胞生长抑制率。 1.6 流式细胞术检测HepG2细胞的细胞周期分布 及凋亡

细胞接种于6孔细胞培养板，分组及转染方法 同1.2，每组设3复孔，于转染后48 h收集细胞，用 4℃预冷的70%乙醇溶液重悬，4℃固定过夜，PI染 色法进行流式细胞术检测。以DNA含量检测细胞 周期分布和凋亡情况。 1.7 统计学方法

应用SPSS17.0统计软件。数据用均数±标准差 （x±s）表示，数据采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 CtBP1 siRNA转染抑制CtBP1蛋白的表达

与对照组相比，干扰组CtBP1的表达水平下 调，差异具有统计学意义（P＜0.05），蛋白质抑 制率为57.80%，对照组之间的差异无统计学意义 （P＞0.05），见图1。

*:compared with control group,P＜0.05 图1 转染后各组HepG2细胞CtBP1的表达 Figure 1 CtBP1 expression after transfected with siRNA in HepG2 cells

转染后24、48、72、96 h，干扰组OD值明 显低于对照组的OD值，差异具有统计学意义（＜0.05）。干扰组细胞生长受到抑制，生长抑 制率在转染后24、48、72、96 h分别为22.34%、 52.15%、53.97%和54.77%，细胞生长曲线低平、 上升缓慢，对照组之间的差异不具有统计学意义 （P＞0.05），见表1和图2。

表1(Table 1)

表1 转染CtBP1 siRNA后各组HepG2细胞的OD值(x±s, n＝5) Table 1 Optical density value of HepG2 cells detected by MTT after CtBP1 knockdown (x±s, n＝5)

表1 转染CtBP1 siRNA后各组HepG2细胞的OD值(x±s, n＝5) Table 1 Optical density value of HepG2 cells detected by MTT after CtBP1 knockdown (x±s, n＝5)

图2 转染CtBP1 siRNA后各组HepG2细胞的增殖情况 Figure 2 Proliferation curves of HepG2 cells after transfection with CtBP1 siRNA

及凋亡 四个组之间细胞周期各时相细胞数的差异 无统计学意义（P＞0.05），未观察到CtBP1 siRNA(h)对HepG2细胞的细胞周期分布有影响作 用，但观察到CtBP1 siRNA(h)对HepG2细胞有促凋 亡作用，与对照组相比，干扰组的细胞凋亡率显 著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），对照 组之间的差异不具有统计学意义（P＞0.05），见 图3、表2。

A:control group;B:transfection reagent group;C:control siRNA group;D:knockdown group 图3 转染CtBP1 siRNA后各组HepG2细胞的细胞周期变化及凋亡情况 Figure 3 Cell cycle distribution and apoptosis cells of HepG2 cells after transfection with CtBP1 siRNA

表2(Table 2)

表2 转染CtBP1 siRNA后各组HepG2细胞的细胞周期变化及凋亡情况(%,x±s, n＝3) Table 2 Cell cycle distribution and apoptosis of HepG2 cells after CtBP1 knockdown(%,x±s, n＝3

表2 转染CtBP1 siRNA后各组HepG2细胞的细胞周期变化及凋亡情况(%,x±s, n＝3) Table 2 Cell cycle distribution and apoptosis of HepG2 cells after CtBP1 knockdown(%,x±s, n＝3

肝癌是常见的恶性肿瘤，死亡人数占到人类 恶性肿瘤的第三位^{[ 3 ]}。其中肝细胞肝癌占到肝癌总 数的75%，肝细胞肝癌的病因包括肝炎病毒、酗 酒、代谢异常和环境毒物等^{[ 4 ]}。发病机制涉及到多 个肿瘤相关基因的异常表达及其参与的多个信号 通路的异常^{[ 5 ]}。

CtBP1是最近发现的一个癌基因^{[ 6 ]}。CtBP1能 与腺病毒E1A蛋白结合，从而解除E1A蛋白羧基末 端的肿瘤抑制作用^{[ 7 ]}。深入研究发现CtBP1可以作 为转录辅抑制因子抑制多个肿瘤抑制基因、上皮 细胞黏附分子的表达，从而调节多种细胞生物学 行为，包括上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、细胞凋亡、细胞周期进程、 迁移、侵袭、血管生成及有丝分裂，从而促进肿 瘤的发生发展^{[ 8, 9 ]}。

应用RNAi抑制CtBP1基因表达后，人乳腺细胞株MDA-MB-231及MCF-7的凋亡增加、增殖能力下 降、细胞有丝分裂减少^{[ 8 ]}；人 结 肠 癌 细 胞 株HCT116 的CtBP1表达下调可促进细胞凋亡^{[ 9 ]}。我们前 期 研 究，发现肝细胞肝癌组织中CtBP1表达上调，肝细 胞肝癌组织中其表达与肿瘤的分级相关^{[ 2 ]}。

为进一步明确CtBP1在肝细胞肝癌中的具体作 用机制，本研究在CtBP1高表达的肝细胞肝癌细 胞HepG2中，采用CtBP1 siRNA下调其表达，并观 察细胞生物学行为改变。结果显示，CtBP1 siRNA 有效抑制了CtBP1蛋白的表达，转染72 h后抑制率 达57.80%。通过MTT法检测细胞增殖，发现干扰 组细胞增殖受到明显抑制，证实了肝细胞肝癌中 CtBP1下调能抑制肿瘤细胞生长，与乳腺癌^{[ 8 ]}和结 肠癌^{[ 9 ]}中的结果相一致。表明CtBP1在肝细胞肝癌 中表达上调可能促进肿瘤的生长，与前期研究发 现的CtBP1高表达者肿瘤分级较高的结果相符^{[ 2 ]}。

流式细胞术分析细胞周期发现，CtBP1沉默48 h后，各组细胞在细胞周期各时相的分布无明显差 别；而凋亡细胞比例显著增加。表明HepG2细胞中， CtBP1表达下调导致细胞生长抑制的主要机制是通 过促进细胞凋亡而非细胞周期阻滞来实现的。 CtBP1作为转录辅抑制因子能抑制多个促凋亡 蛋白的表达，包括pmp-22 相关p53效应因子（p53-effector related to pmp-22，PERP）、PTEN、p21、 Bax和Noxa等^{[ 10 ]}。HepG2细胞中CtBP1干扰导致 CtBP1表达下调，解除了CtBP1对其促凋亡靶基因 的抑制，因而促进了细胞的凋亡，其具体机制仍 需进一步深入研究。

研究表明，CtBP1能抑制p16启动子的活性， 使p16 的表达下调^{[ 11 ]}。p16是一个细胞周期抑制因 子，使细胞周期被阻滞于G₁期。CtBP1能通过对 p16的抑制而促进细胞周期进展。而本研究表明， HepG2细胞中CtBP1沉默对细胞周期分布无明显影 响，可能与HepG2细胞内p16基因的CpG岛高度甲 基化^{[ 12 ]}而表达缺失有关：CtBP1沉默能解除对p16启 动的抑制，但对其CpG岛高度甲基化并无影响；同 时表明CtBP1对细胞周期的影响依赖于p16。

上述数据表明，HepG2细胞中CtBP1沉默通过 促进细胞凋亡而抑制细胞生长。CtBP1是肝细胞肝 癌的潜在治疗靶点。