肺癌的发病率逐年升高，已经成为致死率最高的恶性肿瘤之一。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是ErbB家族成员，是一种跨膜糖蛋白。TKI（络氨酸激酶抑制剂）对EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者具有较好疗效。自从吉非替尼、厄洛替尼等TKI分子靶向药物出现后，获得NSCLC尤其是腺癌的EGFR突变状态成为靶向治疗的关键。

DNA直接测序法是检测EGFR突变状态的金标准，但其敏感度相对较低，当检测组织中肿瘤细胞比例<25%时，假阴性相对较高。近来出现的ARMS、qRT-PCR等方法，由于操作过程复杂、费用高，多数医院无法常规开展相关检测。肺癌患者诊断时多数为晚期，病例标本多为支气管镜活检、经皮肺穿刺及胸水等，所提取的DNA量较少，无法满足直接测序法的要求。E746-A750（19位外显子缺失）、L858R（21位外显子点突变）两种突变方式占所有EGFR敏感突变的90%以上^[1]，2009年Yu等^[2]通过设计针对E746-A750和L858R的兔抗人单克隆抗体开展免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测获得较满意结果。但在临床实践中由于IHC评价系统缺乏统一的标准，导致检测结果的敏感度及特异性差异较大。本研究对136例肺癌患者的各种类型的标本，同时进行EGFR的IHC与直接测序法检测，探讨IHC检测EGFR突变的应用价值。

选择2012年10月至2014年5月在南京市第一医院呼吸科住院的初诊NSCLC同意进行EGFR检测的患者共计136例，平均年龄64岁；所有患者均经病理证实为原发性肺癌；其中男96例、女40例；腺癌97例，鳞癌31例，其他病理类型8例；经皮肺穿刺或气管镜下活检标本71例，手术切除标本47例，经支气管针吸活检（TBNA）胸腔积液或心包积液等体液标本18例，见表1，所有患者均签署知情同意书。

表 1 本组NSCLC患者的基本临床特征 (n) Table 1 Clinicopathological characteristics of patients with lung cancer (n)

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QIAamp DNA Micro KIT（美国Qiagen公司）试剂盒抽提基因组DNA，抗del E746-A 750/mut L858R的兔源单克隆抗体购自美国Cell SignalingTechnology公司，ABI 3710 Genetic Analyzer基因分析仪购自美国Applied Biosystems公司。EGFR测序引物：del19上游引物：5’-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCT-3’，下游引物：5’-CATAGAAAGTGAACA TTTAGGATGTG-3’；mut21上游引物：5’-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3’，下游引物：5’-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3’。

胸水或心包积液离心后去上清液，将沉淀细胞固定、包埋。石蜡标本切片层厚8 μm用于EGFR基因测序。对于测序中发现有缺失或者突变的病例，均用引物进行反向测序验证。将测序结果用DNA sequencing analysis5.1软件分析获取测序电泳图和序列。

梯度酒精至水化，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次1 min。切片采用0.01 mol/L柠檬酸盐（pH6.0）缓冲液进行高温高压修复，冷却至室温。每张切片加1滴3%过氧化氢，室温下孵育10 min， PBS冲洗3次，每次1 min，除去PBS液。每张切片加1滴EGFR抗体，稀释比1:100。玻片置于湿盒中，冰箱4℃过夜。PBS冲洗3次，每次1 min，除去PBS液，每张切片加1滴，室温孵育30 min， PBS冲洗3次，每次1 min。除去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察1~3 min。自来水冲洗，苏木精对比染色1 min，水冲洗、返蓝，切片经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后读片。按照IHC染色强度标记为：无着色为0：淡染色为1+（膜呈淡黄色，仅高倍镜下可见）：中等染色2+（介于1+和3+之间）；强染色3+（膜呈棕褐色，低倍镜下可见）。

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。IHC检测结果的敏感度、特异性及阳性预测值（positive predictive value, PPV）、阴性预测值（negative predictive value, NPV）均以EGFR直接测序法为金标准进行计算，IHC方法与直接测序法的结果一致性检测应用Cohen κ检验。

136例标本中44例发生突变，突变率32.35%（44/136），其中包括L861Q与T790M各1例，27例发生L858R点突变，16例发生delE746-A750del突变（包括L858R+delE749-A750 del和delE749-A750 del+T790M双突变各1例），L858R与E749-A750 del两种突变占所有突变的95.46%（42/44）。97例腺癌中40例发生EGFR突变，突变率为41.23%），非腺癌39例中4例发生突变，EGFR突变率为10.26%，见图1。

A: The red box showed the 2235-2249del15 (E-746-A750del) mutation; B: The arrows showed the L858R c.2573T>G mutation 图 1 DNA直接测序法检测EGFR突变 Figure 1 Direct DNA sequencing assay detected EGFR mutation status

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136例样本中IHC染色标记为0者共计48例，3例存在EGFR敏感突变，突变率为6.25%（3/48）；IHC标记为1+者共计53例，11例存在EGFR突变（其中1例为L861Q点突变，1例为T790M点突变），突变率为20.76%；IHC标记为2+者共计27例，22例存在EGFR突变者，其中1例存在delE749-A750与T790M双突变，1例为delE749-A750与L858R双突变），突变率为81.48%；IHC标记为3+者共计8例，均存在EGFR突变，突变率100%，结果见表2、图2。

表 2 IHC检测与直接测序法检测EGFR突变结果比较 Table 2 Comparison of IHC-based and molecular-based EGFR mutational station

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图 2 特异性抗体检测E746-A750缺失与L858R突变的染色结果评分 (×400) Figure 2 The scores of EGFR del E746-A750 and L858R mutation by IHC staining with specific antibody (×400)

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IHC检测结果以≤1+为阴性，≥2+为阳性。16例经直接测序法证实delE749-A75019突变者， IHC检测结果为：4例IHC 3+，8例IHC 2+，3例IHC 1+，1例IHC 0，敏感度为75%（12/16）；27例经直接测序法证实L858R突变者，IHC检测结果为：4例IHC 3+，15例IHC 2+，6例IHC 1+，2例IHC 0，敏感度为70.37%（19/27）。

活检标本71例，测序法检测突变者25例（包括1例L861Q和L858R+delE749-A750双突变），IHC≥2+者18例，敏感度72%（18/25）；手术标本47例，其中突变者10例，IHC≥2+者7例，敏感度70%（7/10）；细胞学标本18例，其中突变者7例，IHC≥2+者5例，敏感度71.43%（5/7）。

IHC与测序法检测EGFR突变的一致性采用Cohen κ检验。以IHC评分0为阴性，当以≥1+为阳性，敏感度为92.86%，特异度为41.94%，而PPV为44.32%，NPV为93.75%，κ值为0.313，假阳性增加；当以≤1+为阴性，≥2+为阳性，则敏感度为71.43%，特异度为94.68%，而PPV为85.71%，NPV为88.12%，κ值为0.683，此标准与直接测序法的结果一致性较好；而当以≤2+为阴性，＝3+为阳性，则敏感度为19.05%，特异度为100%，而PPV为100%，NPV为76.56%，κ值为0.245，假阴性增加，见表3。

表 3 IHC不同阳性判断标准的结果比较 Table 3 Comparison of different judgment regarding positive criterion for IHC-based results

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TKI已经成为晚期NSCLC患者EGFR敏感突变的一线治疗，快速准确地判断EGFR突变状态对于患者的治疗非常关键。IHC是较常用的应用于较小标本检测的一种可靠的检测方法，IHC方法快速、经济，在小样本包括针吸淋巴结活检、外周体液的细胞切片等均可以进行IHC检测。目前临床上广泛使用的是美国科罗拉多大学的IHC H-score标准，该标准主要根据肿瘤细胞膜或细胞质染色的深度进行评分，较为客观，受主观因素影响较小^[3]。

本研究检测136例肺癌标本总的EGFR突变率32.35%，腺癌的突变率为41.23%，其中delE749-A750与L858R两者占比为95.46%，与国外报道基本一致^[2]。在42例存在delE749-A750与L858R突变的样本中，以IHC≤1为阴性、≥2+为阳性，IHC检测EGFR突变的敏感度、特异性分别为71.43%、94.68%。国外学者在腺癌的小标本、体液中分析IHC与测序法检测EGFR突变的一致性，均认为IHC的敏感度较低，限制了IHC的应用^{[4, 5, 6]}。本研究将IHC分为0~3+四个等级，而不是仅分为0~2+三个等级，结果证实染色强度≥2+敏感度明显提高。

由于肺癌肿瘤异质性的存在，导致不同部位的EGFR突变存在差异，通过微切割技术对离体肺癌肿块进行EGFR检测，可以发现不同部位的肿瘤组织存在突变丰度的差异^{[7, 8]}，那么活检或细胞学等小标本与手术大标本EGFR突变检测是否也存在差异？本研究分析了活检或细胞学标本与手术标本IHC检测的差异，发现活检标本、手术标本及细胞学标本IHC检测的敏感度分别为72%、70%及71.43%，均在70%以上，Fan等^[9]比较了活检小标本与手术标本IHC的敏感度均在80%以上，而Kawahara等^[10]在肺癌患者转移的体液中IHC检测结果与组织一致，也有学者^[11]认为小标本IHC检测的敏感度远低于大标本。

本研究比较了IHC对delE749-A750和L858R两种突变检测的敏感度，发现直接测序法证实的16例delE749-A750和27例L858R突变，以IHC≥2+为阳性，则分别是12例与19例，敏感度分别是75%与70.37%，delE749-A750的敏感度略高于L858R。Allo等^[12]应用IHC检测247例肺癌标本的EGFR突变状态，delE749-A750和L858R的敏感度为分别为83%与76%，与本研究结果一致，而Kitamura等^[13]检测的L858R与delE746-A750的敏感度分别是36%和40%。导致IHC检测结果存在巨大差异的原因主要为临床样本选择的差异、IHC结果判断的不统一以及肿瘤异质性的存在，同时TKI治疗对IHC结果可能存在影响^[14]。关于IHC检测的假阳性，Wen等^[15]学者对535例不同肿瘤类型包括乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等患者进行IHC法检测EGFR突变状态，只有2例乳腺癌出现L858R标记为2+，测序法未发现EGFR突变存在，其余均为0~1+，证实IHC评分≥2+出现假阳性的概率较低。

根据本研究结果认为：如果IHC达到3+，则可以确认存在EGFR的敏感突变，可以不进行进一步分子学检测；对于IHC≥2+者，在组织取材允许的情况下建议二次组织取材，进行EGFR突变状态的分子生物学检测。如果标本量不够，则根据患者具体情况决定是否进行TKI治疗，但存在30%左右的假阳性可能。而IHC在0~1+之间者，在组织标本不充足的情况下建议不进行TKI治疗，患者94.68%不存在EGFR突变。

总之，本研究的结果证实了IHC检测EGFR突变状态具有临床应用价值，以IHC≤1+为阴性，评分≥2+为阳性标准具有较高的敏感度及特异性，对于临床快速筛查EGFR突变状态具有指导价值。