结直肠肿瘤的发病率呈逐年上升状态。AT模体结合因子1（AT motif binding factor 1,ATBF1）基因，是近年来新发现的抑癌基因^[1]。该基因定位于人16q22.3-q23.1，其表达产物能和甲胎蛋白（Alpha fetal protein,AFP）基因的启动子和增强子AT富集区结合，调节AFP的表达^[2]。在ATBF1转录时，由于其mRNA选择性剪接，可产生2种异构体，即ATBF1-A和ATBF1-B，ATBF1-A是ATBF1基因发挥生物学效应的主要产物，相对分子质量高达404 kD，是目前相对分子质量最大的反式作用因子，它能通过结合AFP的启动子，抑制其增强子，从而抑制AFP的表达，并诱导细胞分化与凋亡^[3]。

目前研究发现，ATBF1在神经系统、乳腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、皮肤癌^{[1, 4, 5, 6, 7, 8]}等组织中呈现抑癌基因特征，通过不同机制影响肿瘤的发生、发展。在我们前期对结直肠癌临床病理样本的研究发现，结直肠癌组织与癌旁组织的ATBF1蛋白及mRNA水平上存在差异化的表达^[9]。本研究采用瞬时转染法构建高表达ATBF1的人结直肠癌细胞（LOVO）模型，并利用此模型在体外水平探讨了ATBF1在调控人结直肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭性的作用，并初步阐明其调控机制。

RPMI1640购自美国Hyclone公司。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自杭州四季青公司。脂质体Lipofectamine2000购自美国Gibco公司。TRIzol、CCK-8购自日本TaKaRa公司。RT-PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。ATBF1、Notch3兔抗人单克隆抗体均购自英国Abcom公司。真核表达载体pEGFP-ATBF1，空白载体pEGFP均购自美国Clontech公司。结直肠癌细胞LOVO由南方医科大学细胞生物学教研室保存。

LOVO细胞在37℃、5%CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养，采用含有10%小牛血清的RPMI1640培养液。

实验组采用脂质体Lipofectamine2000，将质粒pEGFP-ATBF1转染入人结肠癌LOVO细胞，对照组为Lipofectmine2000将空白质粒pEGFP转染入LOVO细胞，空白组只采用Lipofectmine2000作用，具体转染操作按试剂盒说明书进行。转染24~72 h后观察报告基因绿色荧光蛋白在细胞中的表达。

将pEGFP-ATBF1转染LOVO细胞，并设空白组和对照组，用TRIzol提取总RNA，测定样本A260/A280及样本浓度。通过北京天根生化科技有限公司的 FastQuant RT Kit（with gDNase）试剂盒进行反转录合成cDNA。由上海生工生物工程有限公司设计并合成ATBF1、内参ACTB引物：ATBF1上游引物： 5’-CAAGTTCACGACGGACAACCT-3’；下游引物：5’-GCTTGCACTGGTATGAGTCCC-3’。ACTB上游引物：5’-GAA ATC GTG CGT GAC ATT AAG-3’； 下游引物： 5’-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG GCC-3’。按照天根公司SuperReal PreMix Plus试剂盒说明书，通过Bio-Rad公司PCR仪器（7500）SYBR ^® Green分析法进行荧光定量PCR检测。反应条件：（1） 95℃ 15 min；（2） 95℃ 10 s，60℃ 60 s，40个循环；（3） 95℃ 15 s，55℃ 45 s，95℃ 15 s。最后以2^-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

采用蛋白印迹法，按照凯基全蛋白提取试剂盒（KGP2100）说明书提取转染后的各组细胞全蛋白。按照BCA蛋白浓度检测试剂盒（南京凯基，KGPBCA）说明书对所提取的总蛋白进行定量。蛋白产物经离心、蛋白变性后，加入Loading buffer上样至SDS-PAGE胶电泳分离，PVDF膜恒流电转，5%脱脂奶粉封闭1 h，Tween-PBS洗膜后加入一抗，4℃过夜孵育，再次洗膜后加入二抗，室温孵育1 h，Tween-PBS洗膜，ECL化学发光法显影，将显影得到的条带进行灰度分析，并通过相对灰度值统计ATBF1、Notch3的表达情况。实验选用GAPDH为内参对照。

将LOVO细胞接种于96孔板，每孔约5 000个细胞，培养贴壁6 h后，按说明书将pEGFP-ATBF1转染入LOVO，设立对照组和空白组，观察转染24、48、72 h后细胞生长情况。在上述各时间点终止培养，每孔加入10 μl CCK-8及100 μl基础培养液，37℃、5%CO₂继续培养1 h，置酶标仪上测OD₄₅₀值，每组5个平行孔。

pEGFP-ATBF1转染LOVO，并设空白组和对照组，48 h后收集约2×10⁶个细胞，l 000 r/min离心10 min，PBS冲洗，加入70%冷乙醇1.5 ml，4℃固定过夜，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

Transwell板上下室之间隔以直径为3 mm无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜（孔径为8 μm），膜上铺匀1:2稀释的基膜胶（Matrige1）。下室加入含10%胎牛血清的完全培养液600 μl。上室加入200 μl各组细胞悬液。置于37℃、5%CO2培养箱中培养12 h，弃去上室液体，取出聚碳酸酯膜，用棉签仔细擦尽膜上Matrigel胶及未穿膜的细胞，甲醛固定5 min，0.1%结晶紫染色后，400倍光学显微镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理。迁移率=穿过膜的细胞数/总细胞数×100%。

应用GeneTools对RT-PCR和Western blot结果进行灰度值分析，上述实验均分别重复三次。应用SPSS21.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用（x±s）表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较应用单因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

未经处理的LOVO细胞完整，大小均匀，贴壁后呈长梭形。经pEGFP-ATBF1转染48 h后LOVO细胞形态发生改变，一部分细胞体积变小，突出减少，呈椭圆形，细胞之间稍有脱离。而对照组，即pEGFP转染的LOVO细胞无明显改变。免疫荧光结果显示，转染入细胞的pEGFP-ATBF1在24 h已在LOVO内表达，见图 1。

图 1 转染24h后的LOVO细胞 Fig. 1 Status of LOVO cells 24h after transfection

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运用2^-△△CT计算出各组细胞的ATBF1 mRNA水平与空白组的相对表达量，结果显示，实验组的ATBF1 mRNA量明显高于空白组与对照组（P<0.001），而空白组与对照组的ATBF1 mRNA差异无统计学意义。与此相反实验组的Notch3 mRNA低于空白组与对照组（P<0.001）。

图 2 ATBF1和Notch3 mRNA的RT-PCR分析结果 Fig. 2 RT-PCR analysis of ATBF1 and Notch3 mRNA

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与PCR检测结果一致，Western blot结果同样可以看出，实验组ATBF1蛋白表达量明显高于空白组与对照组（P<0.001）。而空白组与对照组的ATBF1差异无统计学意义。实验组Notch3的表达量低于空白组与对照组（P<0.05），见图 3。

图 3 ATBF1、Notch3的Western blot分析结果 Fig. 3 Western blot analysis of ATBF1 and Notch3protein

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在转染后24 h内，三组细胞均有不同的增殖趋势，但实验组组并没有明显的增殖趋势，24 h时OD₄₅₀值明显低于其他两组。48 h后，空白组与对照组OD₄₅₀值仍在持续增长，表示细胞数也在增长，而实验组OD₄₅₀值增长缓慢，表示细胞数增加不明显，提示细胞生长受到抑制，甚至可能存在细胞的凋亡、坏死。72 h后，空白组与对照组OD₄₅₀值达到峰值，而实验组OD₄₅₀值已无明显增长趋势，见图 4。

图 4 ATBF1过表达对LOVO增殖的抑制作用 Fig. 4 Overexpression of ATBF1 inhibited growth of LOVO cells

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如图 5所示，Q2、Q4象限，即FITC-C（+），表示早期凋亡的细胞。实验组LOVO细胞的早期凋亡率可达15.93%，而空白组和对照组的LOVO细胞早期凋亡率分别为5.23%和4.57%（P<0.001），表明细胞内ATBF1的高表达可导致LOVO的早期凋亡。

图 5 ATBF1过表达可诱导LOVO细胞凋亡 Fig. 5 Overexpression of ATBF1 induced apoptosis of LOVO cell

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小室上室的LOVO细胞穿过膜上Matrigel胶到膜的下室面，其迁移率的高低反映了肿瘤细胞侵袭能力的大小。收集转染48 h的细胞，采用Boyden小室检测三组细胞的侵袭情况。结果发现，与对照组、空白组比较，实验组的迁移率明显下降（P<0.001)，见图 6。

图 6 ATBF1过表达可降低LOVO细胞侵袭性 Fig. 6 Overexpression of ATBF1 reduced invasion of LOVO cells

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2005年，ATBF1作为一个新发现的抑癌基因首次在前列腺癌的研究中被公开报道，在前列腺癌患者中，ATBF1基因突变率极高，而且突变的ATBF1主要发生在第8~10个外显子，突变后的ATBF1无法表达具有正常抑癌功能的ATBF1完整形式（即ATBF1-A异构体）^{[1, 10]}。除了在前列腺癌，ATBF1在胃癌、乳腺癌、皮肤癌、头颈部鳞癌也均有研究^{[4, 6, 7, 8]}。在胃癌的研究中发现，ATBF1-A的抑癌机制可能与其能与抑癌基因p53蛋白结合，形成ATBF1-p53复合体有关，这种复合体可产生2种调节基因转录的效果：（1）改变ATBF1-A的构象，促进ATBF1-A和AFP基因的增强子结合，抑制AFP基因转录；（2）促进p21基因的转录，加速癌细胞的凋亡进程^[11]。在乳腺癌的研究中发现，ATBF1通过与AIB1竞争性结合到雌激素受体上，从而抑制雌激素介导的细胞增殖，同时还发现高浓度的雌激素可通过介导雌激素反应指蛋白（EFP），导致ATBF1蛋白的降解^{[12, 13, 14, 15]}。

本研究中构建了ATBF1高表达的LOVO细胞模型，并在RT-PCR和Western blot中确认了该模型ATBF1的稳定表达性。Western blot结果显示，转染了pEGFP-ATBF1的LOVO细胞，即ATBF1高表达的实验组，Notch3蛋白的表达水平明显下调。研究表明，ATBF1能经转运进入癌细胞核内，与癌基因MUC5AC的AT模体元件结合，并抑制其转录调节功能^[16]，而MUC5AC能通过激活Notch3信号通路，引起胃肠肿瘤的发生^[17]。实验结果与该结论相符，ATBF1高表达的LOVO细胞抑制了MUC5AC的活性，引起Notch3通路的失活，Notch3表达量下降，研究表明，Notch3通路的激活可以引起癌细胞的侵袭性增加与上皮间质转化^[18]。这也意味着Notch3可能是ATBF1发挥抑癌作用时的一个下游因子。

在CCK-8增殖曲线可以看出，ATBF1高表达的LOVO细胞在转染72 h内，OD₄₅₀值增长缓慢，表明细胞的增殖受到了抑制，显微镜下观察，pEGFP-ATBF1 LOVO细胞体积缩小，细胞质的量减少。与CCK-8的结果类似，Transwell实验也发现，实验组的迁移率明显低于其他两组，说明LOVO的侵袭性也同样受到了抑制。而以往研究发现，抑制ATBF1正常表达的前列腺癌细胞，增殖分化能力增加^[19]。在我们之前对结直肠癌病例样本的研究就已经发现，已转移组的病理样本ATBF1表达量明显低于未转移组^[9]。由此提示，由于ATBF1的缺失或突变，可增加结直肠癌细胞的转移和侵袭能力。

作为一种反式作用调节因子，ATBF1可促进多种癌细胞的凋亡。流式细胞术检测结果提示，转染pEGFP-ATBF1的LOVO细胞早期凋亡率明显高于空白组及对照组。研究表明，ATBF1的核定位可直接影响其蛋白表达^[5]，而ATBF1分子在核外转入核内的过程中，需要与RUNX3结合，并形成一个ATBF1-RUNX3-p53-smads复合体^[20]，而该复合体恰恰就是TGF-β信号通路中的重要一环，ATBF1的缺失，亦将导致复合体的失活，并最终无法介导癌细胞的凋亡。

本研究证实了结直肠癌细胞中ATBF1基因为调控侵袭和迁移的重要因子之一，作为一个抑癌基因，ATBF1对于肿瘤的发生发展起着关键作用。然而在其诱导肿瘤细胞凋亡，并进一步调控侵袭转移的过程，具体是通过何种信号通路和细胞因子协同作用的，仍然有待进一步探索。