肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）在世界范围内是最常见的恶性肿瘤之一，占肿瘤死亡原因第三位^[1]。对HCC的治疗主要为手术治疗，辅以射频消融、放疗等。近年来，由于分子靶向药物在控制肿瘤细胞增殖、预防和延缓肿瘤转移以及提高患者的生活质量等方面具有独特的优势，而成为人们研究的热点。其中，Wnt/β-catenin信号通路因对HCC的发生发展和预后有重要的作用而成为近年来很多学者关注的焦点^[2]。

有研究发现在HCC组织及细胞中，Wnt-1蛋白表达明显增高，而Wnt-1抗体可抑制Wnt/β-catenin通路靶基因c-myc等基因的表达，从而抑制肝癌细胞和小鼠肿瘤组织的生长^[3]。并且，有学者在肝癌组织样本中发现多种突变基因，能够导致Wnt/β-catenin信号通路异常激活^{[4, 5]}。这些均表明Wnt/β-catenin信号通路的异常与HCC的发生发展有密不可分的联系。

IWR-1是一种Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂，其对多种肿瘤细胞均有抑制作用，但对肝癌细胞的研究尚不多见。本研究采用Hep3B细胞作为研究对象，观察IWR-1对肝癌Hep3B细胞株增殖的影响及其可能的机制。

人肝癌Hep3B细胞株由南京医科大学馈赠，DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司，CCK-8试剂购自日本同仁化工研究所，Annexin V FITC/PI细胞凋亡试剂盒及细胞周期试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，IWR-1购自美国Selleck公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）购自美国Sigma公司。电泳仪及电泳槽（美国Bio-RAD公司，508044ZX），流式细胞仪（美国BD公司，FACSCanto Ⅱ），自动凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司），酶标仪（美国Bio-TEK公司，ELX800），CO₂培养箱（美国Themo Fisher Scientific公司，THERMO-forma）等。

采用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，视细胞生长情况及培养液颜色换液传代。后续实验采用对数生长期细胞。

取对数生长期的肝癌Hep3B细胞，消化离心计数后以每孔2 000个细胞的密度接种于96孔板，每孔100 μl。培育24 h待细胞贴壁完全后加入IWR-1，培养液进行浓度梯度稀释，设置四个浓度梯度：2、4、8、16 μmol/L，并同时设置空白组和对照组，空白组只加入培养液而不加入细胞和药物，对照组加入细胞和培养液。每个浓度设置五个复孔，分别培养24、48、72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl，置于培养箱中孵育50 min，采用酶联免疫分析法检测波长为450 nm处的吸光度值（OD值）。计算细胞生长抑制率。

取对数生长期的肝癌Hep3B细胞，消化离心计数后以每孔3×10⁵个细胞的密度接种于6孔板，每孔加入2 ml培养液。培养24 h待细胞贴壁完全后加入浓度为2、4、8、16 μmol/L 的IWR-1，并设置空白对照组，将药物与培养液混匀，培养48 h。收集细胞，用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline,PBS）洗涤细胞，2 000 r/min离心5 min，取单细胞悬液，去除上清液，加入70%预冷的乙醇500 μl固定2 h，4℃保存。PBS去除固定液后染色，加入100 μl RNase A 水浴37℃ 30 min，加入400 μl碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染液混匀，4℃避光孵育30 min。采用流式细胞仪检测细胞周期。

各组细胞常规种板，加药培养，48 h后消化离心收集细胞。PBS洗涤细胞两次，用500 μl结合缓冲液（Binding Buffer）悬浮细胞，分别加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI，混匀后放置于室温、避光、反应10 min后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

取对数生长期的H8713照组。按照说明书提取细胞总RNA，使用快速反转录试剂盒合成cDNA。进行PCR扩增，反应条件为95℃ 15 min，95℃ 10 s，50℃ 20 s，72℃ 30 s。检测各个浓度药物处理组与对照组的mRNA表达水平，采用2^-ΔΔCT法比较mRNA表达差异。β-catenin引物序列：上游：5’-GATTAACTATCAGGATGACACA-3’,下游：5’-TCCATCCCTTCCTGCTTAGTC-3’；C-myc引物序列：上游：5’-TTCGGGTAGTGGAAAACCCAG-3’，下游：5’-CAGCAGCTCGAATTTCTTCC-3’；β-actin引物：上游：5’-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3’，下游：5’-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’。

各组细胞常规种板加药培养，48 h后消化离心收集细胞。PBS洗涤细胞两次，用含有10%苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解细胞，离心5 min后取上清液，用BSA蛋白浓度测定试剂盒检测总蛋白。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，条件为：100 V 30 min，150 V 50 min。将蛋白转膜至PVDF膜上，3%的BSA（Albumin Bovine V）封闭液封闭2 h，1%BSA稀释的一抗，4℃冰箱孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入1%BSA稀释的二抗，摇床孵育1 h 后TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。膜上加入配好的显影剂，自动凝胶成像系统检测分析。

运用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两个样本均数之间采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

IWR-1作用于Hep3B细胞后，随着浓度和时间的增加，细胞的增殖抑制率逐渐增大，呈现剂量和时间依赖性。其中2 μmol/L IWR-1作用24 h后细胞的抑制率为（7.27±1.14）%，而16 μmol/L IWR-1作用72 h后细胞的抑制率高达（79.31±2.13）%。不同浓度组以及不同时间组间比较，细胞增殖抑制率的差异均有统计学意义（均P<0.01），见图 1。

a: P<0.01, vs. control group (untreated with IWR-1) 图 1 IWR-1对肝癌Hep3B细胞增殖抑制率的影响 Figure 1 Inhibitory effect of IWR-1 on the proliferation of human hepatic carcinoma Hep3B cells

图选项

IWR-1作用于Hep3B细胞48 h后，随着药物浓度的增加细胞周期得到了明显的抑制，其中G0/G1期细胞比例升高，而S期细胞比例下降，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），见表 1。

表 1 IWR-1对肝癌Hep3B细胞周期的影响 Table 1 Effects of IWR-1 on cell cycle distribution of hepatic carcinoma Hep3B cells

表选项

同样，随着IWR-1浓度的升高，其作用于Hep3B细胞48 h后的凋亡率逐渐升高，对照组、2、4、8、16 μmol/L作用后的凋亡率分别为（2.36±0.14）%、（4.81±1.21）%、（9.86±0.50）%、（22.84±1.08）%、（36.11±1.33）%，呈现明显的剂量依赖性，各药物处理组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01），见图 2。

A: control group; B: 2μmol/L group; C: 4μmol/L group; D: 8μmol/L group; E: 16μmol/L group 图 2 IWR-1对肝癌Hep3B细胞凋亡的影响 Figure 2 Effects of IWR-1 on the apoptosis of hepatic carcinoma Hep3B cells

图选项

实时荧光定量RT-PCR结果显示，Hep3B细胞β-catenin基因及c-myc基因mRNA表达随着药物浓度的增加而逐渐降低，呈现剂量依赖性。与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01），见图 3。

a: P<0.05, vs. control group (untreated with IWR-1) 图 3 不同浓度的IWR-1对Hep3B细胞β-catenin、c-myc mRNA表达水平的影响 Figure 3 Effect of IWR-1 at different concentration on β-catenin and c-myc mRNA expression in Hep3B cells

图选项

Western blot结果显示，IWR-1对Hep3B细胞的Axin 1、β-catenin、c-myc及p-β-catenin蛋白具有调控作用，Axin 1和p-β-catenin蛋白表达水平随着IWR-1浓度的升高而升高，同时β-catenin和c-myc随着IWR-1浓度的升高而降低，见图 4。

1: control group; 2: 2μmol/L group; 3: 4μmol/L group; 4: 8μmol/L group; 5: 16μmol/L group 图 4 不同浓度的IWR-1对Hep3B细胞Axin1、p-β- catenin、β-catenin及c-myc蛋白表达的影响 Figure 4 Effect of IWR-1 at different concentration on Axin 1，p-β-catenin，β-catenin and c-myc proteins expression in Hep3B cells

图选项

肝细胞肝癌的发生发展受多因素多基因调节和控制，其中Wnt信号通路对肝癌的发生发展有着不可忽视的作用。Wnt信号通路包含有Wnt配体、Wnt受体、Dishevelled蛋白、β-catenin、GSK-3β、Axin/Conductin、APC等^{[6, 7]}。Wnt/β-catenin为经典的Wnt信号通路，β-catenin是整个通路中的关键分子。国内有学者研究发现β-catenin在肝癌组织内表达最高，癌旁组织次之，正常肝组织最低^[8]。特异性干扰β-catenin的表达能够导致肿瘤细胞增殖的降低和凋亡率的升高从而抑制细胞的生长^[9]。因此，提供了以β-catenin作为靶点治疗肝癌患者的新思路。

IWR-1是一种Wnt/β-catenin通路抑制剂，它通过与Axin相互作用并促进β-catenin磷酸化而发挥作用^[10]。已往研究表明，IWR-1对多种肿瘤细胞均有抑制作用^{[11, 12, 13]}。本研究结果显示，随着IWR-1浓度的升高及作用时间的延长，Hep3B细胞增殖抑制率明显上升，呈现明显的浓度和时间依赖性。并且细胞周期阻滞于G0/G1期，S期细胞比例随着药物浓度逐渐下降。同样，细胞凋亡率的上升也呈现明显的剂量依赖性。提示IWR-1可能通过调控Hep3B细胞的细胞周期导致细胞分裂速度减慢，同时细胞凋亡率显著增加从而抑制Hep3B细胞的生长。

在Wnt经典信号通路中，Wnt/β-catenin信号通路被活化，使β-catenin在胞质中积累，并向细胞核转移，同时激活核内转录因子，使β-catenin下游靶基因表达被激活^[14]。本研究结果证明了IWR-1作用于Hep3B细胞可导致Axin 1和p-β-catenin蛋白表达水平升高，而β-catenin和c-myc mRNA和蛋白表达水平下降。陈飞等^[15]研究显示IWR-1能够降低β-catenin蛋白表达水平，与本研究结果一致。Axin上升能够促进GSK同β-catenin的结合，进而促进了β-catenin磷酸化，导致其表达水平降低，转录因子不能被活化，下游靶基因c-myc启动子不能暴露及下游靶基因不能被激活。Wnt通路下游靶基因（c-myc、cyclin、survivin等）大多与肿瘤相关，本研究发现Axin1表达水平升高发挥负性调节作用使β-catenin表达受到影响，导致下游靶基因c-myc表达受到抑制，Wnt/β-catenin通路被抑制。

本研究结果表明，IWR-1对肝癌Hep3B细胞的生长具有抑制作用，其主要机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路而发挥作用。本实验通过体外实验研究了Wnt/β-catenin通路抑制剂对肝癌细胞的作用，为进一步探索肝癌治疗的新方法提供了新的思路。