表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因是非小细胞肺癌的驱动基因，对于晚期或不可手术切除的非小细胞肺癌，EGFR基因检测已成为临床治疗方案选择的重要依据。近年研究表明，EGFR突变状态对化疗药物的影响存在争议，有研究者认为EGFR突变型对化疗疗效优于野生型^{[1, 2]}，也有研究者认为EGFR突变型与野生型的化疗疗效并无明显差异^[3]。紫杉醇联合铂类是非小细胞肺癌的标准治疗方案，本研究以EGFR野生型肺腺癌A549细胞与突变型HCC827细胞（19外显子E746-A750缺失）为研究对象，比较紫杉醇和顺铂对其杀伤作用的差异，并探讨相关的分子机制，为肺腺癌化疗药物选择提供进一步的理论和实验依据。

顺铂（锦州九泰药业有限责任公司）；紫杉醇（海南中化联合制药工业股份有限公司）；MTT实验试剂盒（Sigma公司，美国）；RNA提取试剂盒（QIAGEN公司，美国）；荧光定量PCR试剂盒（Life technologies公司，美国）；酶标仪（Beckman Coulter公司，美国）；实时荧光定量PCR仪（Agilent公司，美国）；人肺腺癌A549细胞株和HCC827细胞株（本实验室冻存）。

用Primer Express 3.0软件设计化疗相关基因（BRCA1、ERCC1、TUBB3）及β-actin基因特异引物，见表 1，经美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库BLAST验证后，由上海英潍捷基贸易有限公司合成。

表 1 化疗相关基因及β-actin基因引物序列 Table 1 Primer sequences of chemotherapy-related genes and β-actin

表选项

采用含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养A549与HCC827细胞。选用对数生长期的细胞进行实验。

将A549与HCC827细胞分别计数并稀释至 5×10⁴/ml，接种于96孔板，每孔200 μl，培养24 h后，分别加入紫杉醇、顺铂，使终浓度为10、20、40、80和100 μg/ml，培养24 h后，每孔加入MTT液（5 mg/ml）20 μl，继续培养4 h，吸去上清液，加入DMSO 150 μl。酶标仪检测OD值（波长490 nm</ span>），分别求出紫杉醇、顺铂的24 h半数抑制浓度（IC₅₀）^[4]。

取A549与HCC827细胞分别计数并稀释至1×10⁵/ml，接种于6孔板，每孔500 μl，培养24 h后，分别加入紫杉醇、顺铂，使终浓度为紫杉醇100 μg/ml、顺铂40 μg/ml，培养24 h后，每孔加入MTT 100 μl，继续培养4 h，吸去上清液，加入DMSO 500 μl。酶标仪检测OD值，相同浓度紫杉醇、顺铂对A549与HCC827细胞的杀伤率（%）=（1-OD实验组OD对照组）×100%^{[5, 6]}。

取A549与HCC827细胞分别计数并稀释至1×10⁵/ml，接种于6孔板，每孔500 μl，培养24 h后，每孔同时加入紫杉醇和顺铂两种药物，使终浓度为紫杉醇100 μg/ml、顺铂40 μg/ml，培养24 h后，每孔加入MTT 100 μl，继续培养4 h，吸去上清液，加入DMSO 750 μl。酶标仪检测OD值，分别求出两药联合对A549与HCC827细胞的杀伤率，利用金氏公式 Q=E（a+b）/（Ea+Eb-Ea×Eb）判断两药的联合用药指数^{[7, 8]}，其中Ea代表紫杉醇的杀伤率，Eb代表顺铂的杀伤率，E(a+b)为两药联合的杀伤率（即实测合并效应），Ea+Eb-Ea×Eb为期望合并效应。Q=0.85~1.15为单纯相加作用，Q>1.15为协同作用，Q<0.85为拮抗作用。

用RNA提取试剂盒分别提取A549与HCC827细胞的RNA，紫外分光光度计检验纯度并定量，将RNA反转录为cDNA。荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green PCR Master Mix（×2）10 μl，上游引物（10 mmol/L）0.4 μl，下游引物（10 mmol/L）0.4 μl，cDNA模板1 μl，加水至总体积20 μl。两步法PCR反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火/延伸1 min，共50个循环。采用相对定量法处理数据，以β-actin为内参，相对含量表示为Z=2^-ΔCt ，其中ΔCt=Ct_{目的基因-}Ct_β-actin。

采用SPSS17.0软件进行统计分析。所有数据均以（x±s）表示，采用两独立样本t检验比较紫杉醇、顺铂对两种细胞杀伤率的差异，采用配对样本t检验比较用药前后化疗相关基因表达的差异，P<0.05为差异有统计学意义。

紫杉醇对A549与HCC827细胞的IC₅₀分别为100、70 μg/ml，顺铂对A549与HCC827细胞的IC₅₀分别为40、50 μg/ml。

相同浓度紫杉醇（100 μg/ml）对A549与HCC827的杀伤率分别为（47.33±3.79）%、（69.33±2.08）%，紫杉醇对HCC827细胞杀伤作用更高（P=0.001）；相同浓度顺铂（40 μg/ml）对A549与HCC827细胞的杀伤率分别为（51.67±1.53）%、（42.00±4.58）%，顺铂对A549细胞杀伤作用更高（P=0.026）。

紫杉醇联合顺铂对A549与HCC827细胞的杀伤率分别为（82.00±5.33）%、（88.96±1.87）%，两药联合对A549与HCC827细胞的杀伤作用无明显差异（P=0.100），药物联合作用Q值分别为1.03、1.06，对两种细胞均表现为相加作用。

如表 2所示，药物作用前HCC827细胞BRCA1基因表达明显高于A549细胞（P=0.021），ERCC1、TUBB3表达差异无统计学意义（P=0.317,P=0.115）。顺铂作用于A549细胞后，ERCC1基因表达明显升高（P=0.010），BRCA1、TUBB3表达变化无统计学意义（P=0.904,P=0.417）。紫杉醇作用于A549细胞后，BRCA1、ERCC1及TUBB3三种基因表达变化均无统计学意义（P=0.516,P=0.434，P=0.417）。顺铂作用于HCC827细胞后，三种基因表达变化均无统计学意义（P=0.962,P=0.873，P=0.615），紫杉醇作用于HCC827细胞后，三种基因表达变化均无统计学意义（P=0.556,P=0.673,P=0.582）。

表 2 紫杉醇、顺铂对A549与HCC827细胞化疗相关基因表 达影响 Table 2 Effect of paclitaxel and cisplatin on chemotherapyrelated gene expression in A549 and HCC827 cells

表选项

EGFR突变状态是肺腺癌分子靶向治疗的重要依据，IPASS等研究表明，EGFR突变状态可能对化疗疗效产生影响^[1]，文献显示，其相关分子机制探讨主要集中在ERCC1等方面^[9]。本课题以细胞系作为研究对象，比较紫杉醇、顺铂对EGFR野生型与突变型细胞杀伤差异，在研究分子机制时，也主要围绕目前关注的与紫杉醇、顺铂关系密切的ERCC1、BRCA1、TUBB3基因^{[10, 11, 12]}，比较两种细胞系中该类基因表达差异，探讨其表达与突变状态的关系及对化疗疗效的影响。

核苷酸切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-complementing 1,ERCC1）与铂类药物的耐药性有关，ERCC1高表达往往表现对铂类耐药^[10]。此外，文献表明，ERCC1表达与非小细胞肺癌EGFR突变状态也有一定关系，但其相关性目前尚无定论，Gandara^[13]和徐小博^[14]等认为EGFR突变型ERCC1基因倾向于低表达，而李惠等^[15]则认为EGFR突变状态与ERCC1表达水平并无相关性。Ⅲ型微管蛋白（β-tubulin-Ⅲ,TUBB3）与紫杉醇等抗微管形成药物疗效关系密切，TUBB3高表达倾向于对紫杉醇耐药^[16]，有研究认为TUBB3表达与EGFR 21外显子突变存在负相关关系^[17]。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1）与铂类、紫杉类药物疗效均有关，研究发现，BRCA1高表达倾向于对铂类耐药而对紫杉类敏感^[18]。化疗药物作用前后，非小细胞肺癌化疗相关基因表达变化情况，目前尚不明确。

本研究表明，EGFR野生型与突变型肺腺癌细胞的ERCC1基因表达无明显差异，这一结果与李惠等^[15]的结论一致。但当顺铂作用后，EGFR野生型肺腺癌A549细胞ERCC1基因表达增加，而EGFR 突变型肺腺癌HCC827细胞ERCC1基因表达无变化，表明野生型比突变型肺腺癌细胞更容易对顺铂耐药，由此推断，EGFR突变型肺腺癌对顺铂有效的维持时间可能更长，这一发现与Zhou等^[19]的BEYONG研究（铂类联合紫杉醇在EGFR突变型与野生型群体中位PFS为7.9 vs. 5.6月，中位OS为27.5 vs. 13.8月）相符合。本实验中，EGFR野生型与突变型肺腺癌细胞TUBB3基因表达无明显差异，EGFR突变型肺腺癌细胞BRCA1基因表达明显高于野生型，提示与&EGFR野生型相比，EGFR突变型肺腺癌细胞对紫杉醇敏感而对顺铂敏感度低，本实验结论在此研究的体外杀伤实验中得到证实。

目前晚期肺腺癌的一线化疗方案中，紫杉醇联合铂类、培美曲塞联合铂类是近年最常用的治疗手段，研究发现，EGFR突变状态对药物疗效存在一定影响。 Mok等^[1]的IPASS研究表明，紫杉醇联合卡铂在EGFR突变型与野生型群体中客观有效率（objective response rate,ORR）分别为47.3%和23.5%，突变型疗效明显好于野生型。张琼等^[3]在培美曲塞联合铂类治疗晚期肺腺癌中得出不同结论，认为EGFR野生型与突变型并无疗效差异（ORR为44.4% vs. 31.8%,P=0.412）。同样，Okamoto等^[20]在培美曲塞联合卡铂一线治疗肺腺癌中发现，EGFR野生型和突变型的化疗疗效并无明显差异（ORR为36.1% vs. 37.5%,P>0.05）。

本研究结果与Okamoto等^[20]的观点相符，但是，本研究为细胞水平研究，与机体环境不同，化疗药物的剂量、应用时间等与临床研究不一致，化疗药物作用过程中可能存在EGFR基因突变状态的改变等^[21]，从而使结果产生偏差。

本研究结果说明，紫杉醇联合顺铂对EGFR野生型与突变型肺腺癌细胞杀伤作用无明显差异，由此推断，晚期非小细胞肺癌EGFR突变状态与化疗药物疗效之间可能并无明显相关性。本研究是细胞水平的研究，尚需开展前瞻性临床试验验证。