长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是指长度大于200个核苷酸，不参与或很少参与蛋白编码的RNA分子，它们在生物体生命活动中发挥着重要而广泛的调控作用^{[1, 2]}。越来越多的证据表明，lncRNA与肿瘤存在密切的关系。肿瘤中这些异常表达的lncRNA可通过多种途径调节DNA甲基化、组蛋白修饰和基因表达，它们在肿瘤的发生、发展和转移中发挥重要作用^[3]。lncRNA与肿瘤间相互关系已逐渐成为研究热点，但目前对于lncRNA在肿瘤发生发展中所发挥的具体功能和调控机制尚不十分明确^[4]。

LncRNA CRNDE（colorectal neoplasia differentially expressed）是结直肠癌差异表达长链非编码RNA，它的转录产物只有很低的编码蛋白能力，因此将其归为长链非编码RNA。CRNDE在许多癌组织或癌细胞（结直肠癌、肝癌、胶质瘤等）中表达出现异常^[5]，其中在胶质瘤中该lncRNA上调14~32倍^[6]，因此推断CRNDE可能在胶质瘤发生发展中发挥重要的功能。目前研究发现，CRNDE与基因的转录和表观遗传学调控存在关系^[7]，并在胰岛素/IGF信号通路中起到承上启下的作用^[8]，但对其在胶质瘤细胞中的功能和作用机制研究较少。

本研究主要从细胞增殖和迁移两方面入手，探讨CRNDE在胶质瘤细胞中发挥的功能和可能参与的信号通路。

人胶质瘤细胞系U87购自中国医学科学院北京协和细胞资源中心。DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所；Trizol、Lipofectamine RNAi MAX购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、Real-time PCR试剂购自日本TaKaRa公司。siRNA由苏州吉玛有限公司合成，引物由Invitrogen公司合成。

针对CRNDE基因设计并合成3对特异性siRNA（si783：GUGCUCGAGUGGUUUAAAUTT，AUUUAAACCACUCGAGCACTT；si809：GGGUAUUCCUGUUUAUAGATT，UCUAUAAACAGGAAUACCCTT；si860：GUCACGCAGAAGAAGGUUATT，UAACCUUCUUCUGCGUGACTT）。细胞培养于含10%血清的DMEM培养液中，于6孔板生长至70%~80%融合度，将100 pmol siRNA稀释于250 μl Opti-MEM培养液，5 μl Lipofectamine RNAiMAX稀释于250 μl Opti-MEM培养液中，静置5 min后混合，室温静置20 min后加入待转染的细胞，37℃、5%CO₂培养箱培养4 h后更换含10%血清的DMEM培养液。

将转染12 h后的细胞用胰酶消化，以5 000~8 000个细胞每孔的数量接种于96孔板中，待细胞贴壁后每孔分别于2、24、36、48 h加入10 μl CCK8检测试剂，CO₂培养箱（37℃、5%CO₂）中继续培养2 h，450 nm读取吸光度值并绘制曲线。实验重复3次。

将转染12 h后的细胞用胰酶消化，按5×10⁵个细胞每孔接种于Transwell小室中。上室为300 μl无血清DMEM培养液，下室为700 μl含20%血清的DMEM培养液。培养8 h后取出Transwell小室，PBS洗2遍，浸入固定液（甲醇:丙酮=1:1）中，室温固定2 h，0.5%结晶紫中染色30 min。小心擦去上室细胞，正置显微镜观察，每个小室取5个视野拍照。

利用Trizol提取未转染及转染CRNDE siRNA的细胞总RNA。将1 μg总RNA反转录为cDNA，基因组DNA的除去及反转录反应采用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa）。Real-time PCR反应体系参考SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）说明书，引物序列见表 1。SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μl，FW Primer 0.5 μl，RV Primer 0.5 μl，cDNA模板1 μl，水8 μl。利用Thermal Cycler Dice Real Time System（TaKaRa）仪器进行实时定量PCR扩增，反应条件如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s，53℃ 20 s，72℃ 20 s，延伸阶段收集荧光信号，重复40个循环；55℃~95℃绘制熔解曲线。反应结束后确认Real-time PCR的扩增曲线和熔解曲线，同次实验每个样本重复三遍。 利用2^-ΔΔCt方法计算目标基因相对表达量。

表 1 目的基因引物序列 Table 1 Primers sequence for Real-time PCR

表选项

利用t检验对Real-time PCR数据进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

利用人工合成的siRNA在胶质瘤U87细胞中对CRNDE基因表达进行干扰，分别于转染后24及48 h提取细胞总RNA，对CRNDE表达水平进行Real-time PCR检测。实验结果显示：3条siRNA（si783、si809、si860）转染胶质瘤U87细胞24 h后，CRNDE表达量下降为原有水平的6%、11%、11%；48 h后CRNDE表达量为原有表达水平的11%、19%、20%，见图 1。说明在转染后24~48 h，3条siRNA对靶基因CRNDE的表达均有良好的抑制效果。

NT: non-transfected cells; si783, si809, si860: cells transfected with CRNDE siRNA 图 1 U87细胞中CRNDE siRNA干扰效率验证 Figure 1 Interference efficiency of CRNDE siRNA in U87 cells

图选项

利用CCK8试剂对转染CRNDE siRNA的U87细胞进行细胞增殖分析。转染CRNDE siRNA的细胞增殖受到明显抑制。转染12 h后，si783、si809、si860抑制率分别为16%、23%、18%；转染24 h后，3条siRNA抑制率分别为13%、19%、14%；转染48 h后，抑制率分别为10%、22%、12%，见图 2。结果表明，CRNDE siRNA能抑制胶质瘤细胞的增殖，CRNDE基因可能起到促进细胞增殖的作用。

图 2 干扰CRNDE基因表达对胶质瘤细胞增殖能力的影响 Figure 2 Cell proliferation was suppressed by interfering CRNDE expression

图选项

利用Transwell实验，研究CRNDE对胶质瘤U87细胞系迁移能力的影响。将转染CRNDE siRNA的U87细胞与未转染细胞分别接种于Transwell小室，8 h后显微镜观察。转染CRNDE干扰siRNA的U87细胞穿过膜上小孔的能力明显降低，见图 3。说明CRNDE siRNA能抑制胶质瘤细胞的迁移，CRNDE基因可能具有增加胶质瘤细胞迁移的功能。

A: NT; B: si783; C: si809; D: si860 图 3 干扰CRNDE基因表达对胶质瘤细胞迁移能力的影响 (×20) Figure 3 Cell migration was suppressed by interfering CRNDE expression (×20)

图选项

对MAPK/ERK通路上关键蛋白及相关转录因子基因表达水平进行Real-time PCR分析，结果显示该通路涉及的主要蛋白激酶及受其调控的转录因子RNA表达量均有不同程度下降。MAPKKK类激酶Raf1基因表达水平在si783、si809、si860三个干扰表达细胞系中分别下降为未转染细胞的39%、67%、86%；MAPKK类激酶MEK2基因表达水平降低为未转染细胞的32%、39%、67%；MAPK类激酶ERK1表达水平降至61%、43%、45%，ERK2表达水平降至72%、63%、46%。与未转染细胞相比，CRNDE干扰表达细胞系中转录因子NF-κB表达水平降至38%、69%、39%，c-Myc表达水平降至45%、46%、65%，见图 4。

*: P<0.05, **: P<0.01, compared with NT group 图 4 干扰CRNDE表达影响MAPK/ERK通路基因表达水平 Figure 4 Gene expression in MAPK/ERK signal pathway after interferring CRNDE expression

图选项

长链非编码RNA在生物体生命活动中发挥广泛的调控作用，众多证据表明，lncRNA与肿瘤的发生发展存在密切关系^[9]。Iyer等研究人员对7 256个肿瘤、正常组织和细胞系样本进行高通量RNA测序分析，构建了全基因组lncRNA表达模式，共鉴定出3 900条lncRNA与疾病相关SNP位点重叠，7 942条lncRNA可能与癌症相关。研究表明，lncRNA具有成为新的肿瘤标志物的可能，它们将在未来肿瘤诊断和治疗上发挥重大作用^[10]。lncRNA CRNDE在许多癌组织或癌细胞中表达出现异常，在胶质瘤中该lncRNA上调14~32倍^[6]。Zhang等^[6]对GEO数据库中胶质瘤样本芯片数据进行分析，发现127个lncRNA在胶质瘤和正常脑组织中出现表达差异，其中CRNDE为变化最大的lncRNA，其在胶质瘤中平均表达增加了32倍。利用Affymetrix HG-U133 Plus 2.0芯片数据平台，其他研究者也对胶质瘤组织或细胞系进行lncRNA表达模式分析，均确认了CRNDE在胶质瘤中的过量表达模式^{[11, 12]}。上述研究证据指出，CRNDE可能在胶质瘤发生发展中发挥重要的功能。

CRNDE的生物功能和作用机制研究主要集中在结直肠癌细胞系上。Khalil等研究发现，CRNDE可以与染色质修饰复合体多梳蛋白聚合体2（polycomb repressive complex 2,PRC2）和RE-1元件辅助沉默因子（corepressor for element-1-silencing transcription factor,CoREST ）发生相互作用^[7]，它可能在染色质表观遗传学调控中发挥功能。Ellis等研究发现，在结直肠癌细胞系HCT116和HT29中，CRNDE转录本表达被胰岛素/IGF起始的PI3K/Akt/mTOR和Raf/MAPK两条信号通路调控；敲低CRNDE gVC-In4转录本，影响了一系列与insulin/IGF通路相关基因表达。据此Ellis等推测CRNDE 在 胰岛素/IGF信号通路中起到承上启下的作用^[8]。

本研究从细胞增殖和迁移两方面入手，探讨CRNDE在胶质瘤中的生物功能。结果表明，胶质瘤U87细胞系转染CRNDE基因干扰siRNA后，lncRNA CRNDE表达量显著降低，其细胞增殖和迁移能力受到明显抑制。说明CRNDE与细胞的增殖和迁移能力密切相关，CRNDE表达增加可能提高胶质瘤细胞的增殖和迁移。本研究主要从细胞水平揭示CRNDE的生物功能，实验室后续将对CRNDE在动物体内的作用进行研究，将CRNDE干扰表达的U87细胞和正常U87细胞分别皮下注入裸鼠体内进行成瘤实验，观察肿瘤发展进程，从体内角度验证CRNDE基因对胶质瘤的影响。

MAPK信号通路在细胞中广泛存在，它将细胞外信号转导至细胞内，引发一系列激酶的级联反应，从而激活细胞质中靶蛋白或作用于核内转录因子调节靶基因表达。MAPK信号通路与细胞增殖、分化、迁移及凋亡等过程密切相关。研究发现存在多条MAPK信号通路，在哺乳动物细胞中，与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号通路，目前对其激活过程及生物学意义已有了较深入的认识^[13]。转染CRNDE干扰siRNA的胶质瘤U87细胞中，MAPK/ERK通路涉及的一系列主要蛋白激酶表达水平均有不同程度的降低。在3个干扰细胞系中，MAPKKK类激酶Raf1，MAPKK类激酶MEK2，MAPK类激酶ERK1、ERK2表达量均降为正常细胞系的50%左右。因此，我们推测CRNDE可能对MAPK/ERK通路起到激活作用，通路中关键蛋白激酶基因表达被激活，使得下游靶蛋白磷酸化程度提高，相关转录因子活性增加，最终导致许多调节细胞生长、迁移、侵袭等功能蛋白活性增强。此外，干扰细胞系中转录因子NF-κB、c-Myc表达也显著降低，这些转录因子在肿瘤发生发展过程中起着重要而复杂的作用^{[14, 15, 16]}。推测CRNDE可能提高这些转录因子的表达水平，它们的高表达可导致一系列肿瘤相关基因的异常表达，从而抑制肿瘤细胞凋亡，促进正常细胞转化及肿瘤的转移等。

因此，本研究推测lncRNA CRNDE可能通过调控MAPK/ERK通路关键蛋白激酶，引发一系列蛋白磷酸化水平变化及转录因子表达变化，增加MAPK/ERK通路活性，从而提高胶质瘤细胞增殖及迁移能力。而抑制该lncRNA能降低细胞增殖和迁移活性，从而减缓肿瘤发展进程。本研究为将CRNDE应用于胶质瘤的诊断、治疗及预后提供了理论依据，为寻找新的抗胶质瘤药物靶点提供了一条思路。