肿瘤防治研究  2016, Vol. 43 Issue (03): 181-187
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管,湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

杨向东,杨文华,刘宝山,伊学军,高宏,姚芳,王兴丽,闫理想.
YANG Xiangdong, YANG Wenhua, LIU Baoshan, YI Xuejun, GAO Hong, YAO Fang, WANG Xingli, YAN Lixiang.
蝎毒多肽提取物对白血病细胞株K562/A02荷瘤鼠耐药性的影响
Reversion Impact of Peptide Extract from Scorpion Venom on Multidrug-resistance of Leukemia Stem Cell Line K562/A02 in vivo
肿瘤防治研究, 2016, 43(03): 181-187
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2016, 43(03): 181-187
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2016.03.003

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收稿日期: 2015-05-19
修回日期: 2015-09-25
蝎毒多肽提取物对白血病细胞株K562/A02荷瘤鼠耐药性的影响
杨向东1, 杨文华1, 刘宝山2, 伊学军1, 高宏1, 姚芳1, 王兴丽1, 闫理想3     
1. 300381 天津,天津中医药大学第一附 属医院血液科;
2. 300052 天津,天津医科大学总医院中医 科;
3. 300193 天津,天津中医药大学研究生院
摘要: 目的 探讨蝎毒多肽(peptide extract from scorpion venom, PESV)逆转白血病干细胞(leukemia stem cells, LSC)在体内多药耐药(multidrug resistance, MDR)的分子机制。方法 以多药耐药的K562/A02细胞株成模白血病BALB/c裸鼠为例,成模鼠随机分为6组:模型对照组、阿霉素(ADM)组、PESV组、ADM+PESV(H)组、ADM+PESV(M)组、ADM+PESV(L)组。模型对照组给予等体积0.9%氯化钠溶液腹腔注射,其余各组予相应剂量ADM和(或)PESV腹腔注射,连续给药14天。第21天观察各组裸鼠移植瘤生长情况,分别检测瘤块中LSC:细胞膜上P-gp的表达,细胞质中ALDH、PI3K的变化及细胞核中MDR1、NF-κB的活性。结果 K562/A02细胞经免疫磁珠分选前后的CD34+CD38-细胞比率和IC50值分别为31.5%、(60.33±10.68)μg/ml和92.8%、(58.33±9.72)μg/ml,分选后细胞干性显著提高,而耐药性无差异性损失;各组造模裸鼠成瘤率100%。瘤体中LSC:流式细胞仪检测细胞膜上P-gp表达结果:检测对照组89.8%、ADM组91.9%、PESV组88.4%、ADM+PESV(H)组53.9%、ADM+PESV(M)组78.0%、ADM+PESV(L)组78.7%;半定量RT-PCR检测MDR1 mRNA的表达:PESV组>ADM+PESV(L)组>ADM+PESV(M)组>ADM+PESV(H)组>ADM组;免疫组织化学检测ALDH,显示灰度值ADM组>PESV组>ADM+PESV(H)组>ADM+PESV(M)组>ADM+PESV(L)组;Western blot检测PI3K分子与Elisa检测NF-κB因子结果一致,在ADM组、PESV组表达上调,在ADM+PESV组中表达下调,下调强度与PESV剂量呈正相关。结论 PESV具有下调白血病干细胞膜上P-gp,细胞质内ALDH、PI3K及细胞核中MDR1、NF-κB的表达水平,增强了白血病K562/A02干细胞在体内对ADM的敏感度,逆转其多药耐药特性。
关键词: 白血病     蝎毒多肽     K562/A02     BALB/c裸鼠     多药耐药     逆转    
Reversion Impact of Peptide Extract from Scorpion Venom on Multidrug-resistance of Leukemia Stem Cell Line K562/A02 in vivo
YANG Xiangdong1, YANG Wenhua1, LIU Baoshan2, YI Xuejun1, GAO Hong1, YAO Fang1, WANG Xingli1, YAN Lixiang3     
1. Hematology Department, The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China;
2. Traditional Chinese Medicine Department, General Hospital Affiliated to Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China;
3. Postgraduate School, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
AbstractObjectiveTo investigate the molecular mechanism of the reversion impact of peptide extract from scorpion venom(PESV) on multidrug resistance(MDR) of leukemia stem cells(LSC) in vivo. Methods Took leukemia BALB/c nude mice modeled by K562/A02 cell line for example, they were randomly divided into six groups: Model control group, ADM group, PESV group, ADM+PESV high-dose(H) group, ADM+PESV middle-dose(M) group, and ADM+PESV low-dose(L) group. Model control group received an equal volume of 0.9% sodium chloride solution by means of intraperitoneal injection, and other groups received the corresponding dose of ADM and (or) PESV in the same way, and all groups were continuously medicated for 14d. On d21, the transplanted tumor growth were observed in nude mice of each group, and we respectively detected the LSC in the tumor block: the expression levels of P-gp on the membrane, the content of ALDH and PI3K in the cytoplasm, and the activities of MDR1 and NF-κB in the nucleus. Results Before and after K562/A02 cells were selected with immunomagnetic beads, CD34+CD38- cells ratio and IC50 were 31.5% and (60.33±10.68) μg/ml, 92.8% and (58.33±9.72) μg/ml, respectively. After the selection, the stemness of the cells was significantly improved, while no difference of drug-resistance was showed. Tumor formation rate of modeled mice in each group was 100%. The testing results of LSC in the tumor block were as follows: the expression of P-gp on the membrane tested by flow cytometry were 89.8% in model control group, 91.9% in ADM group, 88.4% in PESV group, 53.9% in ADM+PESV(H) group, 78.0% in ADM+PESV(M) group, and 78.7% in ADM+PESV(L) group; the expression levels of MDR1 mRNA detected by semiquantitative RT-PCR were PESV group>ADM+PESV(L) group> ADM+PESV(M) group> ADM+PESV(H) group>ADM group; the gray values of ALDH tested by immunohistochemistry were ADM group>PESV group> ADM+PESV(H) group>ADM+PESV(M) group> ADM+PESV(L) group; PI3K protein and NF-κB factor were respectively detected by Western blot and Elisa, and both expression levels were up-regulated in ADM group and PESV group, down-regulated in ADM+PESV groups, moreover, the down-regulated levels showed a positive correlation with the dose of PESV. Conclusion PESV could reduce the expression levels of P-gp on the membrane, ALDH and PI3K expression in the cytoplasm, and MDR1 and NF-κB expression in the nucleus, which result in enhancing the sensitivity of LSC K562/A02 to ADM and eventually reversing its multidrug resistance.
Key words: Leukemia     Peptide extract from scorpion venom(PESV)     K562/A02     BALB/c nude mice     Multidrug resistance (MDR)     Reversion    
0 引言

白血病细胞对化疗药物产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象是急性白血病(acute leukemia,AL)化疗失败及复发的主要原因之一[1]

白血病细胞MDR的根源是白血病干细胞(leukemic stem cells,LSC)MDR使LSC残留在患者体内[2]。MDR的LSC通常会发生几种改变:细胞膜ATP结合盒式蛋白(ATP-binding cassette,ABC)家族中ABCB1编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和ABCG2编码的乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)表达上调[3],外排进入细胞内化疗药物;细胞质中磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)激活下游核转录因子(nuclear factor,NF-κB)启动多药耐药基因(multidrug resistance 1,MDR1)[4]和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase1,ALDH1)氧化胞质中醛类物质如环磷酰胺(CTX)的中间代谢产物醛磷酰胺等水解化疗药物活性基团[5];细胞核内NF-κB和MDR1过度表达介导白血病LSC的MDR细胞信号通路;LSC在细胞膜、细胞质和细胞核中各种分子的改变帮助其实现MDR。课题组前期研究发现蝎毒多肽(peptide extract from scorpion venom,PESV)可以通过上调柔红霉素(DNR)损伤细胞的PTEN基因、tie-2基因表达改变KG1α干细胞凋亡与分化[6],也有研究表明PTEN基因上调Bax等多种信号分子,逆转K562/ADM细胞的MDR现象[7],这提示PESV有逆转白血病细胞耐药的可能。所以,拟采用经典髓系白血病MDR的K562/A02细胞株[8]成模白血病BALB/c裸鼠为例,探讨PESV在体内逆转白血病干细胞MDR作用的分子机制。

1 材料与方法 1.1 白血病细胞株

耐阿霉素(adriamycin,ADM)K562/A02细胞株由中国医学科学院血液病研究所提供。

1.2 实验动物

BALB/c裸小鼠,雌性,6~7周龄,体质量18~22 g,共计40只,购自北京华阜康动物公司[SCXK(京)2014-0004],在SPF级环境下饲养,采用滤膜饲养笼,裸鼠所需饲料、饮水及其他物品均高压灭菌。

1.3 实验药物

采用电刺激东亚蝎尾采集新鲜毒液,经高速离心分离,真空干燥制成蝎毒干粉,-20℃保存。从蝎毒冻干粉按文献[9]提取蝎毒多肽,含50~60氨基酸的多肤混合物,分子量6 000~7 000,纯度89.1%,耐热,pH稳定,使用前用0.9%氯化钠溶液溶解稀释到所需浓度。

1.4 实验试剂

RPMI 1640培养液(HyClone公司);10%胎牛血清(Gibco公司);CCK-8试剂盒(索罗门生物科技有限公司);CD34 Micro Bead Kit-Human(Miltenyi Biotec公司,130046702);CD38 Micro Bead Kit-Human(Miltenyi Biotec公司,130046702);MACS分选架及LD、MS柱(Miltenyi Biotec公司);P-gp抗体试剂盒(美国BD公司);Anti-ALDH1 antibody试剂盒(英国Abcam公司);Elisa检测试剂盒(美国BD公司);Western blot检测试剂盒(北京世纪康为公司);RT-PCR试剂盒 ( 北京康为世纪公司),MDR1基因引物序列[10]:上游引物:5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’,下游引物:5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’;BCRP基因引物序列[11]:上游引物:5’-ATTGAAGGCAAAGGCAGATG-3’,下游引物:5’-TGAGTCCTGGGCAGAAGTTT-3’;内参照β-actin引物序列:上游引物:5’-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGTGCC CAT CTA-3’,下游引物:5’-CTA GAA GCA TTTGCG GTG GAC GATGGAGGG-3’。

1.5 实验方法 1.5.1 细胞培养

常规复苏液氮冻存K562/A02细胞,置于含15%胎牛血清的RPMI 1640(100 u/ml青霉素和100 mg/ml链霉素)培养液中常规培养,每3~4天传代1次。培养条件:5%CO2、37℃恒温培养箱。

1.5.2 K562/A02干细胞分选

采用免疫磁珠法分选K562/A02干细胞,收集1×108个对数生长期的K562/A02细胞,严格按照 MACS磁珠分选说明书进行,经流式细胞仪分析样本中1×104个细胞中的阳性细胞数,鉴定后实验备用。

1.5.3 CCK-8检测细胞增殖活性

收集K562/A02细胞稀释至16×104个/毫升。按0、500、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000细胞数梯度接种于96孔板(A~H,1~3),每孔最终体积200 μl。每梯度设3个平行孔。收集K562/A02细胞稀释至4×104个/毫升,每孔100 μl接种于96孔板(B~G,4~8)。将ADM(10 mg)稀释至 4 80 μg/ml,按0、15、30、60、120、240 mg浓度分别加入96孔K562/A02细胞中(B~G,4~8),每孔终液200 μl,每梯度设5个平行孔。取200 μl PBS加入边缘孔作为对照。培养72 h,每孔加入 8 μl CCK8溶液,再孵育1 h,用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值(OD值)及计算细胞IC50

1.5.4 K562/A02干细胞植入BALB/c成模及分组给药

实验预先选取5只BALB/c小鼠,经皮下注射K562/A02干细胞,每次间隔3天,每次注射0.2 ml(5×107个/毫升),形成皮下瘤块备用。再将30只雌性BALB/c小鼠给予裸鼠直线加速器3 Gy全身照射后,经包埋穿刺针接种0.2 cm×0.2 cm大小瘤块1处。成模裸鼠随机分为6组:对照组、ADM组、PESV组、ADM+PESV(H)组、ADM+PESV(M)组、ADM+PESV(L)组。对照组予0.9%氯化钠溶液腹腔注射,其余各组予腹腔注射ADM和(或)PESV。ADM 1 mg/kg[按成人每天40 mg/m2换算],腹腔注射0.05 mg隔天1次(第1、3、5、7、9、11、13天),PESV按高、中、低(5、1、0.2 μg)剂量腹腔注射给药14天,PESV组PESV剂量同中剂量组给药。第21天颈推脱臼处死小鼠。

1.5.5 流式细胞术检测P-gp

剪取1 g中心部位的瘤组织,PBS(0.01 mol/L,pH7.0~7.2)冲洗3次,同组标本混合。将组织充分剪碎,加入100 μl胶原酶消化(37℃、30 min),过滤。加1 ml PBS,混匀,过滤,离心洗涤2遍(2000 r/min,5 min),计数。取1×106细胞,加入5 μl FITC M-H P-gp抗体,避光,4℃,孵育30 min。加 1 ml PBS洗涤(2000 r/min,5 min),上机检测。

1.5.6 RT-PCR检测MDR1

mRNA表达

剪取1 g中心部位的瘤组织,PBS(0.01 mol/L,pH7.0~7.2)冲洗3次,同组标本混合。用TRIzol法提取移植瘤总RNA,反转录成cDNA。将cDNA模板用去离子水稀释5~10倍后用于Real-time PCR,反应体系50 μl(PCR MasterMix 25 μl、Forward Primer 2 μl、Reverse Primer 2 μl、Template cDNA 1 μl、PCR Enhancer 10 μl、RNase-Free Water up to 10 μl);反应条件为95℃预变性5 min;95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40个循环;72℃终延伸 5 min。设β-actin为管家基因,同时检测。本次半定量RT-PCR检测结果比较时,设2-△△Ct测定值≥5为高表达标准。

1.5.7 免疫组织化学法检测ALDH1

用10%甲醛固定瘤块,常规脱水、浸蜡、包埋,切片6 μm、贴片置入65℃恒温箱内烤片20 min,HE染色;免疫组织化学染色:脱蜡、水化,抗原修复液(配制:柠檬酸三钠3 g、柠檬酸0.4 g、加蒸馏水1 L)行抗原修复,3%H2O2室温10 min灭活内源性过氧化氢酶,5%BSA液封闭 30 min,Anti-ALDH1 antibody一抗4℃隔夜孵育,山羊抗兔二抗染色,DAB染液显色反应,苏木精对比染色3 min,中性树胶封片,显微镜下观察染色结果,照相。

1.5.8 Western blot检测PI3K蛋白

剪取1 g中心部位的瘤组织,PBS(0.01 mol/L,pH7.0~7.2)冲洗3次,同组标本混合,加1 ml液氮研磨,200 μl蛋白裂解液,吹打混匀,4℃摇晃震荡10 min,冰上裂解30 min。4℃,12 000 r/min,离心30 min,取上清液总蛋白,采用BCA方法测蛋白浓度,样本煮沸5 min使变性,冰上冷却后10 000 r/min离心30 s,取上清液进行SDS-PAGE,然后转移蛋白至PVDF(100 V,1 h),0.5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1 h,分别加入一抗40℃孵育过夜,0.1% TBST洗膜3次,室温孵育加入二抗1 h ,TBST洗膜3次,加ECL发光剂后显影。

1.5.9 ELISA法检测NF-κB含量

剪取1 g中心部位的瘤组织,PBS(0.01 mol/L,pH7.0~7.2)冲洗3次,同组标本混合,加入5~10 ml预冷研磨,5 000 g离心5 min,取上清液。将标准品稀释为10 ng/ml (标准曲线最高浓度)后,再依次倍比稀释成10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0 ng/ml。酶标板分别设标准孔、待测样品孔、空白孔,标准孔7孔,依次加入100 μl不同浓度的标准品,空白孔加100 μl,余孔加待测样品100 μl,覆膜,37℃温育2 h。弃液,甩干,加试剂盒中A液,覆膜,温育1 h。弃液浸泡,洗板3次,1~2 min,覆膜,温育30 min,加试剂盒中B液,覆膜,温育30 min,弃液,加底物溶液90 μl,避光显色,弃液,加终止溶液50 μl终止反应,用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。

1.6 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 K562/A02干细胞耐药性

对数生长期K562/A02细胞,在免疫磁珠分选前经流式细胞仪检测CD34+CD38-细胞占31.5%,见图 1A,CCK-8法检测耐药率得到IC50值为(60.33±10.68)μg/ml,经免疫磁珠分选后检测CD34+CD38-细胞占分选后细胞的92.8%,见图 1BIC50值为(58.33±9.72)μg/ml,分选后K562/A02细胞干性显著性提高,而耐药性无差异性损失,适合以下动物实验。

图 1 K562/A02细胞分选前后CD34+CD38-细胞比率 Figure 1 CD34+CD38- K562/A02 cell ratio before and after selection
2.2 BALB/c裸鼠成瘤情况

BALB/c裸鼠皮下包埋K562/A02瘤块后7天,100%出现不同程度成模表现:消瘦、弓背症状、皮下包块存在,见图 2A。按照瘤体大小随机分组实验。各组小鼠给药14天,未出现死亡,顺利完成实验,期间观测瘤组织大小,见图 2D。外周血常规变化情况,见表 1

A: blank group and control group; B: control group tumors; C: tumors HE(20×); D: tumor volume growth curve
Tumor volume calculation formula: V=lw2/2 (l: longest diameter, w: shortest diameter)
图 2 成模裸鼠、瘤体情况及肿瘤体积曲线 Figure 2 Model mice, tumors and tumor volume growth curves

表 1 BALB/c裸鼠外周血细胞计数 (x±s) Table 1 Peripheral blood cell count in BALB/c nude mice (x±s)
2.3 LSC细胞膜上P-gp表达

BALB/c荷瘤裸鼠在ADM药物刺激作用下瘤块细胞P-gp表达由89.8%轻度上调至91.9%,在PESV刺激作用下无明显改变88.4%;在ADM与PESV联合作用下P-gp表达下调,ADM+PESV(H)组53.9%、ADM+PESV(M)组78.7%、ADM+PESV(L)组78.0%,呈现对PESV浓度依赖关系,见图 3

A: FACS detection figure of P-gp expression quantity among groups; B: P-gp expression of each group; ADM: adriamycin; PESV: polypeptide extract from scorpion venom 图 3 BALB/c裸鼠瘤块中LSC细胞膜上P-gp的表达比率 Figure 3 P-gp expression ratio on LSC cytomembrane of tumor blocks in BALB/c nude mice
2.4 LSC细胞质中ALDH1、PI3K分子水平

经IHCA检测裸鼠移植瘤组织中ALDH1结果显示,对照组与ADM组、PESV组相比,ALDH1阳性表达率无明显差异,ALDH1阳性表达在ADM+PESV(H/M/L)3组中逐渐减少,ADM+PESV(H)组<ADM+PESV(M)组<ADM+PESV(L)组,与PESV剂量相关,见图 4

A: control group; B: ADM group; C: PESV group; D: ADM+PESV(H) group; E: ADM+PESV(M) group; F: ADM+PESV(L) group 图 4 各组移植瘤免疫组织化学检测结果比较 (HE ×20) Figure 4 Comparison of immumohistochemical condition of transplanted tumor among groups (HE ×20)

PI3K蛋白在ADM组、PESV组表达上调,在ADM+PESV组中表达下调,下调强度从高到低依次:ADM+PESV(H)组>ADM+PESV(M)组>ADM+PESV(L)组,见图 5

A: PI3K protein analysed by Western blot; B: histogram of PI3K protein relative expression; PI3K: phosphoinositide 3-kinase. 1: control group; 2: ADM group; 3: PESV group; 4: ADM+PESV(H) group; 5: ADM+PESV(M) group; 6: ADM+PESV(L) group 图 5 Western blot分析BALB/c小鼠瘤块K562/ADM细胞 PI3K水平 Figure 5 PI3K expression level in K562/ADM cells in tumor blocks of BALB/c mice analysed by Western blot
2.5 LSC细胞核内NF-κB、MDR1 mRNA表达

标准曲线:使用专业制作曲线软件Curve expert 1.30进行分析,以标准品的浓度为纵坐标,OD值为横坐标,依据回归方程R2值绘出标准曲线。用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度。R2=0.9996,绘制标准曲线,见图 6A。NF-κB值:对照组6.438 ng/ml,ADM组7.139,PESV组8.866,ADM+PESV(H)组5.876,ADM+PESV(M)组6.594,ADM+PESV(L)组7.159,见图 6B

A: typical standard curve of NF-κB; B: comparison of NF-κB expression quantity among groups 图 6 NF-κB标准曲线及各组中NF-κB浓度比较 Figure 6 Standard curve of NF-κB and comparison of NF-κB concentrations among groups

测得K562/A02干细胞的MDR1 mRNA基因表达量PESV组>ADM+PESV(L)组>ADM+PESV(M)组>ADM+PESV(H)组>ADM组,其中PESV组、中剂量组、低剂量组高表达,见表 2

表 2 BALB/c裸鼠瘤块细胞MDR1 mRNA表达情况 Table 2 MDR1 mRNA expression in tumor block cells of BALB/c nude mice
3 讨论

LSC产生MDR阻碍了化疗治愈白血病,尽管一些MDR机制已经提出,但MDR机制极其复杂,是肿瘤细胞对化学药物攻击的重要防御机制。

LSC依靠细胞膜ABC超家族中P-gp药物泵降低细胞内化疗药物浓度,P-gp是Biedler等于1976年在研究CHO细胞时发现的,在多药耐药细胞的细胞膜上存在一种分子量为1.7×105道尔顿,整个分子由几乎完全相同的两个亚基构成,每部分具有6个跨膜区和一个ATP结合位点,P-gp位于细胞膜和细胞质的高尔基体,两者是P-gp转运药物的重要场所[12]

LSC在细胞质中表达的ALDH1是一种解毒细胞溶质酶,能氧化细胞内的乙醛变成乙酸,包括视黄醇转变成视黄酸,视黄酸具有调节细胞增殖和分化的功能,并能维系不同干细胞的表型[13]。ALDH1位于9q21染色体,由53×103个碱基对组成,含13个外显子,共编码501个氨基酸,无重复序列,N端为蛋氨酸(Met),有1个谷氨酸(Glu)和1个半肤氨酸(Cys)激活点,其基因启动区含1个ATA盒和1个CCAAT盒,分别位于转录起始部位上游的32 bp和74 bp处[14]。研究证实ALDH1与恶性肿瘤的耐药性相关[15],它能氧化环磷酞胺的中间代谢产物醛磷酞胺,形成无毒的梭基磷酞胺,从而发挥对环磷酞胺的解毒作用。

此外,LSC形成MDR的PI3K/NF-κb/MDR1信号通路激活细胞核内MDR1基因,MDR1 cDNA位于人类7号染色体的q21.1带上,编码4.5~5.0 kb mRNA,长4 669 bp,其第179~3 840 bp为可读区,起始密码为ATG,共编码1 280个氨基酸残基,经折叠修饰后形成定位于细胞质和高尔基体的P-gp[16]。白血病细胞表面的酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinases,RTK)通过接收胞外多种生长因子如胰岛素(Insulin)、成纤维细胞生长因子(FGF)、人生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等配体信号刺激而被激活,激活的RTK通过PI3K将信号转递到细胞内激活AKT。AKT属于PI3K重要的下游分子,激活IκB激酶(IKKα)进而导致NF-κB的抑制剂IκB的降解,使NF-κB从细胞质中释放出来进行核转位,NF-κB与MDR1基因启动子结合,MDR1的DNA完成mRNA转录。这样,LSC贯穿细胞膜、细胞质及细胞核的MDR机制体系形成。

PESV是蝎毒多肽提取物的简称,是由蝎毒冻干粉经葡聚糖凝胶,收集蝎毒Ⅲ~Ⅳ蛋白峰,再进行阳离子交换层析而成。PESV组份Ⅲ通过下调bcl-2基因和激活Caspase-3途径促进人肝癌细胞株Hep G2的凋亡[17],PESV组份Ⅳ作用及机理尚未明确。本次实验中发现PESV和ADM都能够独立激活LSC细胞膜、细胞质及细胞核的MDR机制体系,ADM组、PESV组与对照组相比MDR1 mRNA高表达,P-gp、ALDH、PI3K同样出现差异性升高;但是,当PESV和ADM联合应用时LSC却未表现出MDR体系作用的增强,相反随着PESV剂量增加MDR体系作用在减弱,ADM+PESV(H)组、ADM+PESV(M)组、ADM+PESV(L)组相比ADM组、PESV组出现信号通路中PI3K蛋白、NF-κB因子表达开始下调,P-gp、ALDH、MDR1的表达水平显著性下调,与PESV剂量呈正相关;以上结果证实了LSC在ADM损伤后PESV对其MDR的逆转作用显著性增强,PESV可以提高白血病细胞对ADM的敏感度,这与大黄蛰虫丸含药血清[18]和植物雌激素毛蕊异黄酮[19]的研究结果相一致。然而LSC的MDR除细胞膜、细胞质及细胞核的分子改变外,还与LSC在龛内迁移、活化、G0期变化等方面细节尚需进一步研究探讨。

参考文献
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