前列腺癌是男性最常见的肿瘤之一，其发病率在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中已跃居第3位^[1]。多数前列腺癌患者在早期对雄激素去势治疗有效，然而最终难免发展为“去势抵抗性前列腺癌”（castrate resistant prostate cancer,CRPC）^[2]。一氧化氮（nitric oxide,NO）作为信使物质或效应分子在体内发挥极其重要的生理作用，NO生成不足或NO信号转导异常与多种疾病的形成和发展密切相关^[3]。NO对肿瘤生长具有双重作用：低浓度NO通过参与血管形成等效应促进肿瘤生长，而高浓度则通过诱导细胞凋亡等机制抑制肿瘤细胞增殖^[4]。研究显示NO可以逆转CRPC化疗耐药性并阻断癌细胞存活，显著提高CRPC对传统治疗方法的敏感度^{[5, 6, 7]}。除诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）经刺激因素作用能产生大量NO外，NO前体药也是获得高浓度NO的有效途径。NO前体药具有多种结构类型，如有机硝酸酯、硝普盐、S-亚硝基硫醇和偶氮二醇烯鎓盐等。本文将以硝酸甘油（glyceryl trinitrate,GTN）、硝普钠（sodium nitroprusside,SNP）、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（S-nitroso-N-acetyl penicillamine,SNAP）、JS-K和DETANONOate为代表，阐述其抗肿瘤和对其他肿瘤治疗手段增敏的活性，并对NO前体药的应用难题及设计新思路进行探讨。

NO是由活体组织细胞中的L-精氨酸、氧分子以及尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenined inucleotide phosphate,NADPH）在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）的催化下发生氧化反应生成的一种重要的细胞间与细胞内信息传递物质，半衰期通常为1~5 s。NOS分为内皮型（eNOS）、诱生型（iNOS）和神经型（nNOS）3种同工酶^[8]。研究表明^[9]，NO广泛分布于多种组织和器官中，多种细胞可以产生NO，包括肿瘤细胞、内皮细胞、神经细胞等。NO可作为一种信号传递分子在以神经系统为中心的组织中发挥神经递质的功能；也可作为一种效应分子，直接发挥杀伤靶细胞、微生物等作用，并参与机体炎性反应、免疫调节、肿瘤等多种生理及病理功能的调节^[10]。

NO参与调节不同生理/病理过程的机制中，其中一个关键机制是将NO代谢产物中的亚硝基部分连接到其反应作用的半胱氨酸残基上，从而形成S-亚硝基硫醇，而这个过程被称为S-亚硝基化^[11]。大量研究证明，蛋白的S-亚硝基化和磷酸化相似，在细胞的生理调节中起关键调节作用。事实上，虽然蛋白上多个半胱氨酸残基可被S-亚硝化，但仅少部分参与调节蛋白的特异性功能^[12]。许多转录调节因子的S-亚硝基化修饰参与调控哺乳动物的相关基因的转录活性^[13]。S-亚硝基化不仅在正常细胞的生理调节中起作用，同时在肿瘤形成、肿瘤细胞侵袭转移和死亡中也起到关键的调节作用。越来越多的研究表明，NO介导调控肿瘤发生发展是通过相关蛋白的S-亚硝基化方式实现的。因此，在肿瘤发生发展的生理机制中，关键蛋白的S-亚硝基化（如Caveolin-1^[14]S-亚硝基化后可抑制Caveolin-1蛋白降解及诱导凋亡，并促进肿瘤细胞转移；HIF-1α^[15]S-亚硝基化后可稳定HIF-1α的聚集和活性，并促进肿瘤细胞血管生成等）可能可以解释NO调控肿瘤形成、保护、诱导凋亡和侵袭转移等方面的机制。

体内NO生成不足或NO信号转导异常与多种疾病的形成和发展密切相关，外源性补充体内NO不足、恢复NO正常的信号转导使NO前体药物（NO-donor）及其相关药物应运而生^[16]。NO前体药物是一类能在体内无需经NOS催化自行或与其他物质作用产生NO的物质。NO前体药物有多种类型，而用于抗肿瘤研究较多的NO前体药物主要包括有机硝酸酯、硝普盐、S-亚硝基硫醇和偶氮二醇烯鎓盐等^[17]。

有机硝酸酯是治疗和预防心绞痛的常用药。有研究表明，它们可通过多种机制增强肿瘤对化放疗的敏感度，并可在一定程度上抑制肿瘤增殖及预防肿瘤的侵袭转移，其中，硝酸甘油（glyceryl trinitrate,GTN）最具代表性。Frederiksen等^[18]对人前列腺癌细胞DU-145的研究发现，与单用阿霉素组相比，硝酸甘油或硝酸异山梨酯联合阿霉素组癌细胞的相对存活率可明显降低；进一步的深入研究，利用sGC抑制剂和PKG抑制剂抑制NO信号通路，发现DU-145对阿霉素的敏感度下降，而由8-溴-cGMP激活NO信号通路，则可使肿瘤细胞对化疗药物的敏感度增强；说明小剂量的硝酸甘油和硝酸异山梨酯可能通过释放NO而激活cGMP通路，从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感度。在裸鼠皮下种植人前列腺癌细胞PC-3移植瘤，待肿瘤体积达到200~250 mm³时，分组给药，对照组每周2次阿霉素腹腔注射，试验组在对照组基础上，加用硝酸甘油透皮贴剂，5周后，分离肿瘤组织，计算肿瘤体积，结果显示，与单用阿霉素组比较，加用透皮贴剂组裸鼠的平均肿瘤体积缩小了40%。前列腺特异抗原（prostate specific antigen,PSA）是诊断前列腺癌及评价治疗预后的敏感指标^[19]，对生化指标复发的前列腺癌患者的研究显示，持续（>31.8月）、低剂量（0.033~0.2 mg/h）、局部释放的硝酸甘油胶囊疗法可延长患者PSA的倍增时间，在一定程度上缓解了复发性前列腺癌的发生发展^[20]。

硝普钠（sodium nitroprusside,SNP）是硝普盐类NO前体药的代表，早在20世纪70年代就已用于高血压危象患者的急救。龙智等^[21]利用SNP研究外源性NO对前列腺癌的增殖与凋亡的影响，发现前列腺癌细胞生存率与低浓度SNP呈正比，而与高浓度SNP呈反比；高浓度SNP可作用于细胞G1期，并诱导细胞凋亡，结果还显示，经过SNP处理的前列腺癌细胞中p21wafl/cipl基因表达的丰度要明显高于正常对照组和低浓度组，细胞周期的分布也发生了显著变化；因此，高浓度SNP可诱导前列腺癌细胞凋亡，并推测其诱导凋亡的途径可能与p21wafl/cipl基因的表达有关。临床研究^[22]发现在前列腺癌组织中过表达转化生长因子（transforming growth factor,TGF-β1）会引起尿液和血液中TGF-β1的增高，继而导致癌细胞血管生成和转移的发生率增加。Wang等^[23]研究NO与TGF-β1的关系，利用包括SNP在内的四种不同的NO前体药作用于三种前列腺癌细胞系48 h后发现，四种NO前体药呈不同程度地抑制TGF-β1的表达，其中0.5 mmol/L的SNP抑制约50% TGF-β1生成率，且在一定范围内，NO对TGF-β1的抑制作用呈时间及浓度依赖性。以上研究说明SNP抑制前列腺癌细胞的生长可能是通过下调TGF-β1的表达，进而抑制癌细胞生长。

S-亚硝基硫醇类化合物是生物体内普遍存在的物质，可在生理条件下缓慢持续释放NO，而NO在有氧环境中也可以与某些含巯基的物质结合形成S-亚硝基硫醇，S-亚硝基硫醇的代表药物为S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）。Chaiswing等^[24]研究发现100 μmol/L SNAP可使DU-145、PC-3、WPE1-NB26等三种前列腺癌细胞的侵袭能力分别下降65%、53%和29%；进一步试（实）验中，将腺病毒介导的超氧化物歧化酶（SOD）基因转染至前列腺癌细胞内，96 h后分泌到细胞外的SOD增加，引起胞 外超氧阴离子的水平降低、基质金属蛋白酶的活性降低、胞外亚硝酸盐的浓度增加，从而导致DU-145和PC-3细胞的侵袭能力降低；以上研究表明SNAP可通过释放NO，改变前列腺癌细胞外的氧化还原状态，从而降低癌细胞的侵袭能力。

偶氮二醇烯鎓盐^[25]一般可由烷基胺、吡咯、哌嗪或哌啶与NO和甲醇钠的甲醇溶液在NO吸附剂（如纳米二氧化钛，TiO₂）催化下生成，经过生物酶的催化形成氧负离子，氧负离子在生理条件下不稳定，极易释放NO，半衰期从几分钟到几小时不等，代表药物有JS-K（化学式为{O₂-(2,4-dinitrophenyl)-1-[(4-ethoxycarbonyl)piperazin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate})和DETANONOate(化学式为[(Z)-1-[N-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl）amino]diazen-1-ium-1,2-diolate]）。O₂端烷基化修饰的偶氮二醇烯鎓盐可提高其稳定性，不同基团修饰O₂端的JS-K^[26]可在特异酶的作用下，在特定部位释放出定量的NO。

Laschak等^[27]为检测JS-K是否影响雄激素受体（androgen receptor,AR）的转录活性，在AR阳性的CRPC前列腺癌细胞系22RV1运用共转染技术，在含浓度为5 nmol/L双氢睾酮的培养液中培养44 h后发现，随着浓度的增加，JS-K对AR活性的抑制呈上升趋势，而JS-K模拟物无此现象；进一步实验发现，JS-K调节AR转录活性与WNT信号通路有关，并呈一定浓度依赖性。体外前列腺癌细胞和体内PC-3成瘤裸鼠实验结果均表明，DETANONOate释放的NO可抑制肿瘤细胞及组织中转录因子NF-κB生存/抗凋亡通路及其下游转录抑制子YY1水平，并上调DR5表达，增加肿瘤细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）诱导凋亡的敏感度^[28]。此外，将PSA底物的类似物小分子肽通过烷酰氧甲基分别与偶氮鎓二醇盐的O₂连结，生成物被PSA活化后，可以靶向释放NO，进而诱导前列腺癌细胞凋亡^[29]。Huerta-Yepez等^[30]研究了DETANONOate增强顺铂对癌细胞的敏感度，利用高浓度（500~1 000 μmol/L）DETANONOate作用于对顺铂耐受的前列腺癌细胞系PC-3和DU-145，发现其通过抑制YY1和Bcl-xL的表达，最终引起细胞凋亡；细胞试验结果在 动物试验上 也得到了验证，成功在裸鼠身上种植PC-3移植瘤后，同时给予DETANONOate和顺铂治疗，结果发现，相比单独用药组和空白组，试验组能够明显抑制移植瘤的生长。

上述NO前体药物均具有较好的抗肿瘤活性，能有效地抑制前列腺癌细胞生长及诱导凋亡作用，并对其他治疗手段具有增敏作用^{[31, 32]}，对前列腺癌临床治疗具有积极的意义。然而，由于NO为性质活泼的气体分子并且生理作用广泛，过量的NO有可能对正常组织造成影响，这大大限制了NO前体药在临床上的应用。

NO对癌症是把“双刃剑”，高浓度的NO（如活化巨噬细胞需要的NO浓度^{[33, 34]}）可以诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤生长^[35]，而相对低浓度的NO则促进肿瘤细胞生长和增殖^[36]。因此，控制外源性NO前体药物的靶向释放高浓度NO，是NO前体药物抗肿瘤研究的关键^[37]。产生上述两种不同肿瘤生物学效应的NO浓度需要存在1~2个数量级的浓度差异^[38]，也就是说发挥细胞毒作用或诱导肿瘤细胞凋亡的NO浓度比产生促瘤作用的NO浓度要高10~100倍。目前NO前体药物没有肿瘤细胞特异性，对正常组织也有毒性损害甚至导致恶变可能。因此，开发安全性、靶向性且不良反应少的新型NO前体药物迫在眉睫。

靶向作用^[39]是所有药物研究都希望解决的共同难题，对于NO前体型抗肿瘤药来说显得尤为重要，NO在体内的作用极其广泛，并且在某种情况下可能产生毒性。近年来，研究者主要从以下两种策略来解决NO前体药物靶向作用这一难题。

这一策略主要是将能自动释放NO的前体药物如偶氮二醇盐（NONOates）转化为稳定的NO前体药。由于这种前体药是通过体内特定酶能够识别或活化的载体与NO前体药物偶联获得的，因此有可能在该酶富集的肿瘤组织内激活NO前体药物，从而达到局部释放NO杀死癌细胞的目的^[40]。

设计对特定组织具有高度亲和力的NO前体药物，或将其与对特定组织具有高度亲和力的载体相连，生成物在体内靶向转运到特定组织，释放NO^[29]。如在JS-K的基础上，合成新型NO前体药物并使之与纳米金棒偶联，再将合成的前列腺特异性膜抗原（PSMA）核酸适体（PSMA-a10）结合到纳米金棒表面，从而使新药不仅具有前列腺癌靶向性还能克服其全身不良反应。同时，该药物需要在近红外光照射后才可以释放NO，从另外一个方面保证NO准确的局部释放。这两方面的改进使得该药物具有安全性、强靶向性，激光活化NO前体药物的成功开发将促进前列腺癌的临床治疗，尤其是对难治性前列腺癌可以用此NO前体药进行可控的精准治疗。目前该前体药正在深入研究中。

多年来，人们对NO前体药物及其相关药物显示了广泛的兴趣，其研究进展令人鼓舞。NO从癌变的发生到发展的不同阶段均发挥作用，是肿瘤起始、生长和转移过程中的重要因子。NO可以作为肿瘤治疗的一个新方向，其能增强难治性肿瘤细胞对化疗、放疗和免疫学治疗的敏感度。但NO前体药物的应用仍需更深入的研究和更多的临床试验以对NO为基础的肿瘤防治进行探讨，相信在不久的将来，NO前体药物必将拥有更好的发展前景并获得更广泛的应用。