急性T淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL）是一类严重威胁人类健康的血液系统恶性疾患，在儿童及成人发病率较高。目前主要采取联合化疗来治疗T-ALL^{[1, 2]}，但患者死亡率仍很高而且容易复发。因此迫切需要新的治疗策略提高T-ALL的生存率。

NOTCH信号通路与肿瘤的关系最早发现于急性T淋巴细胞白血病^[3]。T-ALL发生时NOTCH会被异常地和组成性地激活^{[4, 5]}，NOTCH信号通路的激活释放出NOTCH的细胞内肽段/细胞内活化形式（intracellular notch,ICN）^{[6, 7]}，ICN在造血干细胞中表达的增加引起T-ALL。有研究报道，大约有55% T-ALL患者带有NOTCH1获得性功能突变，说明NOTCH1的异常激活是T-ALL的重要发病机制。γ分泌酶抑制剂Compound E（GSI）能够有效抑制NOTCH1的激活，但GSI作用不专一，除了阻断NOTCH1信号通路的激活，同时还阻断了其他NOTCH信号通路，出现明显不良反应。因此，寻找靶向NOTCH1下游靶基因的药物是今后T-ALL治疗的重要方向。HES1作为已发现的直接受NOTCH1信号通路正调控的基因，对NOTCH1信号通路过度激活所致T-ALL的发生与维持具有至关重要的作用，HES1的表达水平反映NOTCH1的细胞内活化形式ICN1的活性^{[8, 9]}，因而HES1作为NOTCH1信号通路效应分子。

微小RNA（microRNA,miRNA）是长度20~24 nt的非编码小RNA，通过与mRNA 特异性结合实行转录后负性调节基因表达。新近研究发现miRNA确定在T淋巴细胞分化和发展的各阶段发挥着重要的生理功能，并且参与了各类癌症包括T-ALL的形成和恶性发展^{[10, 11, 12]}。

DNA结合抑制因子4（inhibitor of DNA binding 4,ID4）与肿瘤的发生和干细胞的分化关系密切，该基因的表达缺失与多种急性白血病的发生密切相关。在多种白血病细胞中沉默ID4基因会促进白血病的发生，因而ID4基因是一个明确的抗白血病基因^{[13, 14]}，但是调控机制仍然不十分明确。本研究旨在探索ID4在T-ALL中的表达情况以及NOTCH1与ID4的相关性，并深入探究NOTCH1与ID4之间的调控机制，为遏制T-ALL发生发展提供新的可行方案。

胎牛血清购自美国Gibco公司；RPMI 1640培养液购自美国Hyclone公司；细胞转染试剂盒V购自瑞士Lonza公司；γ分泌酶抑制剂Compound E（GSI）购自德国Merck公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；氯仿、无水乙醇和异丙醇购自天津天力化学试剂有限公司；Trizol、miRNA分离试剂盒和miRNA反转录试剂盒均购自美国Life Technologies公司；反转录试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；SYBR Green购自美国BIO-RAD公司；RIPA裂解液购自上海Beyotime公司；ID4一抗（兔源多克隆抗体）购自英国Abcam公司；HRP标记的二抗购自美国Cell Signaling公司；PGL3质粒及Dual-luciferase检测试剂盒购自美国Promega公司；miR-342抑制体（miR-342 inhibitor）、miR-342抑制体阴性对照（无关序列，miR-342 inhibitor NC）、miR-342模拟物（miR-342 mimics）及miR-342模拟物阴性对照（无关序列，miR-342 mimics NC）均由上海吉玛生物公司设计合成。

人源急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞、PCDH-ICN质粒包装慢病毒感染后经嘌呤霉素筛选得到过表达ICN的Jurkat细胞及与其配对的对照组PCDH质粒包装慢病毒感染后经嘌呤霉素筛选得到的Jurkat细胞均来源于Warren S Pear实验室。其培养液是含有10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰氨、1 mmol/L丙酮酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇的RPMI 1640。5%CO₂、37℃培养。

使用目前公认的miRNA靶基因预测数据库TargetScan、picTar、RNA22、PITA和miRanda共同预测可以靶向ID4的miRNA。对将预测出来的miRNA序列与靶基因ID4 3’UTR进行碱基互补比对并计算结合稳定性。

为证明miR-342特异作用于ID4 3’UTR区域，构建含有ID4 mRNA的3’UTR（PGL3/ID4）及其3’UTR突变体（PGL3/mut）的双荧光报告基因系统。方法是针对ID4 3’UTR预测结合miR-342区域，设计PCR引物，将PCR产物连在骨架质粒PGL3中海肾（Renilla）的下游，导入感受态细胞后摇菌，进行克隆筛选后送苏州金唯智生物科技有限公司基因测序，结果经比对正确后再摇菌小提得到目的质粒PGL3 /ID4。在Jurkat细胞中共转染miR-342 inhibitor、miR-342 mimics和PGL3/ID4，只转PGL3 /ID4作为对照，24 h后使用Dual-luciferase检测试剂盒读取萤火虫（firefly）信号和海肾（Renilla）荧光信号，以Rellina/firefly相对荧光值作比较。对确认有效的ID4 3’UTR区域，利用重叠PCR原理设计引物制造结合区域点突变，余过程如上。经苏州金唯智生物科技有限公司测序明确的miR结合区域点突变后，提取得到PGL3/mut，共转染验证是否miR-342还能结合并调控Renilla表达。

根据Lonza Cell Line Nucleofector Kit V 试剂盒说明书，用核转染仪4D-Nucleofector（Lonza）分别将miR-342 inhibitor、miR-342 inhibitor NC、miR-342 mimics及miR-342 mimics NC转入Jurkat细胞，方法如下: 细胞计数仪计数细胞，锥虫蓝拒染实验检测细胞存活率后将1×10⁶ 细胞用1.5 ml RPMI 1640完全培养液接种于12孔培养板，37℃、5%CO₂培养箱中预热。细胞移至1.5 ml EP管中，室温下800 r/min离心5 min，弃上清液，细胞用100 μl预热到室温的核转染液（Nucleofector Solution 82 μl+Supplement 18 μl）混悬，并加入30 nmol/L miR-342 inhibitor/miR-342 inhibitor NC/miR-342 mimics/miR-342 mimi cs NC，转移到Lonza核转染杯的底部，避免产生气泡，盖上杯盖。将核转染仪的程序设置为CL-120，并将核转染杯放入杯孔中，按“X”键开始程序。结束后立即拿出转染杯，并用Lonza标准吸管吸出移至含有1.5 ml完全培养液的12孔板中。48 h后收集转染后的细胞，进行后续实验。

利用Trizol提取细胞总RNA，取1 μg总RNA做反转录反应。PCR扩增程序如下: 50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共进行40个循环。PCR引物分别为: 18 s上游引物：5′-GCGCCGCTAGAGGTGAAAT-3′，下游引物：5′-GGCGGGTCATGGGAATAAC-3′；HES1上游引物：5′-TCAACACGACACCGGATAAA-3′，下游引物：5′-TCAGCTGGCTCAAGACTTTCA-3′；ID4上游引物：5′-TGAACAAGCAGGGCGACAG-3′，下游引物：5′-CCCTCTCTAGTGCTCCTGGCT-3′。

利用miRNA分离试剂盒提取细胞miRNA，取1 μg miRNA利用miRNA反转录试剂盒做反转录反应。PCR扩增程序如下: 50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共进行40个循环。miR-342的特异性反转录引物及PCR引物均由上海吉玛生物公司设计合成。

收集DMSO处理组、GSI处理组及不同转染组的Jurkat细胞，加入蛋白裂解液，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg样品蛋白质加入等体积上样缓冲液，经SDS-PAGE后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。室温封闭1 h，加入1:1 000稀释的ID4一抗，4℃孵育过夜，β-actin作为内参照，TBST振摇漂洗5 min×3次，然后加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，取出，TBST 振摇漂洗5 min×3次，化学发光法检测后分析结果，结果用Image J软件分析条带灰度值。

采用SPSS 17.0统计软件处理数据，以均数±标准差（x±s）表示，均数间的比较采用t检验或方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

根据Oncomine数据库，ID4在T-ALL患者（174例）中的表达量为正常捐献者（74例）的（0.425±0.021）倍（P<0.01），结果表明T-ALL患者中ID4的表达水平明显低于正常组，见图 1。

r=0>

**: P<0.01,compared with normal donors; T-ALL: T-cell acute lymphoblastic leukemia; ID4: inhibitor of DNA binding 4 图 1 Oncomine数据库中ID4在T-ALL患者与正常组中表达水平的分析结果比较 Fig. 1 Comparison of ID4 expression levels in 174 T-ALL patients and 74 normal donors from Oncomine database

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推测T-ALL中ID4的低表达可能与NOTCH1的过度激活有关。通过分析源于Pieters R数据库的92例T-ALL患者样本中HES1与ID4表达水平的相关性（http://r2.amc.nl,last accessed August 20,2015），可知HES1与ID4呈负相关（r=-0.242,P=0.02），见图 2，由此间接表明ID4可能受NOTCH1负调控。

图 2 源于Pieters R数据库的92例T-ALL患者中HES1与ID4表达水平的相关性 Fig. 2 Correlation between HES1 and ID4 expression levels of 92 T-ALL patients from Pieters R database

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将Jurkat细胞分别用1 μmol/L可阻断NOTCH1信号通路激活的γ分泌酶抑制剂Compound E（GSI）和空白对照DMSO处理48 h，qRT-PCR结果显示，与DMSO空白对照组相比，GSI组的ID4 mRNA表达水平上调至223%（t=30.1,P=0.001），见图 3A；Western blot法检测和灰度结果分析显示GSI组的ID4表达上调至233%（t=28.8,P=0.001），见图 3B。

A: qRT-PCR results of HES1 and ID4 mRNA expression in Jurkat cells with GSI-mediated NOTCH1 inhibition; B: Western blot results of ID4 protein expression in Jurkat cells with GSI-mediated NOTCH1 inhibition; C: qRT-PCR results of HES1 and ID4 mRNA expression in Jurkat cells with PCDH-ICN-mediated NOTCH1 activation; D: Western blot results of ID4 protein expression in Jurkat cells with PCDH-ICN-mediated NOTCH1 activation; *: P<0.05 /span> 图 3 阻断或激活NOTCH1信号通路后，Jurkat细胞中ID4的mRNA和蛋白水平表达 Fig. 3 ID4 mRNA and protein expression in Jurkat cells with GSI-mediated NOTCH1 inhibition or PCDH-ICN-mediated NOTCH1 activation

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qRT-PCR和Western blot法检测已转染PCDH-ICN能激活NOTCH1信号通路及其对照PCDH组的Jurkat细胞中ID4的表达，结果显示，与PCDH对照组相比，PCDH-ICN组的ID4 mRNA表达水平下调至43%（t=19.3,P=0.000），见图 3C；ID4蛋白表达水平下调至48%（t=9.2,P=0.000），见图 3D。

通过目前公认的miRNA靶基因预测数据库TargetScan、picTar、RNA22、PITA和miRanda共同预测到只有miR-342可以结合于ID4 mRNA 3’UTR区的第559~566号碱基，见图 4A。

A: the binding site of ID4 mRNA 3’UTR predicted by TargetScan,picTar,RNA22,PITA and miRanda algorithms analysis; B: Schematic representation of the reporter for miR-342 activity against the ID4-3’UTR; C: miR-342 mimics and inhibitor caused specific contrary effect towards ID4-3’UTR after using the reporter system in Jurkat cells (P<0.05),but no significant effect in the ID4-3’UTR-mutant(P>0.05); *: P<0.05,compared with control group; 1: Control; 2: miR-342 mimics; 3: miR-342 inhibitor 图 4 ID4 mRNA的3’UTR区与miR-342相结合 Fig. 4 miR-342 directly targeted ID4 by interacting with its 3’UTR

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构建含有ID4 mRNA 3’UTR的双荧光素酶报告载体，称为PGL3/ID4，见图 4B，结果表明当PGL3/ID4组与miR-342 mimics共转染后，较对照组海肾相对荧光（Renilla/firefly）减少到58%（t=11.4,P=0.000）；与miR-342 inhibitor共转染后，海肾相对荧光升高到125%（t=15.7,P=0.001）；而PGL3/mut分别与miR-342 mimics或miR-342 inhibitor共转染后海肾相对荧光基本无改变（P>0.05），见图 4C，提示miR-342可以与ID4的3’UTR区相结合。

将miR-342 inhibitor NC、miR-342 inhibitor、miR-342 mimics NC及miR-342 mimics转染Jurkat细胞48 h，检测细胞中ID4的mRNA及蛋白表达水平。qRT-PCR结果显示，与miR-342 inhibitor NC对照组相比，miR-342 inhibitor组ID4 mRNA表达水平上调至225%（t=21.5,P=0.000），见图 5A；与miR-342 mimics NC对照组相比，miR-342 mimics组的ID4 mRNA表达水平下调至37%（t=19.4,P=0.001），见图 5B。Western blot法检测和灰度结果分析显示miR-342 inhibitor组的ID4表达相比miR-342 inhibitor NC对照组上调至233%（t=10.7,P=0.001），见图 5C；miR-342 mimics组的ID4表达相比miR-342 mimics NC对照组下调至30%（t=18.4,P=0.000），见图 5D。

A: qRT-PCR results of miR-342 and ID4 expression in Jurkat cells transfected with miR-342 inhibitor NC or miR-342 inhibitor,*: P<0.05,compared with miR-342 inhibitor NC or blank group; B: qRT-PCR results of miR-342 and ID4 expression in Jurkat cells transfected with miR-342 mimics NC or miR-342 mimics,*: P<0.05,compared with miR-342 mimics NC or blank group; C: Western blot results of ID4 protein expression in Jurkat cells transfected with miR-342 inhibitor NC or miR-342 inhibitor; D: Western blot results of ID4 protein expression in Jurkat cells transfected with miR-342 mimics NC or miR-342 mimics 图 5 下调miR-342或上调miR-342、Jurkat细胞中ID4的mRNA和蛋白水平表达 Fig. 5 ID4 mRNA and protein expression in Jurkat cells after down- or up-regulation of miR-342

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对Jurkat细胞分别用1 μmol/L GSI和DMSO处理24 h，再将miR-342 mimics分别转染上述GSI和DMSO处理组细胞48 h，检测DMSO空白对照组、GSI处理组和GSI+miR-342 mimics转染组的细胞中miR-342的表达和ID4的mRNA及蛋白表达水平。qRT-PCR结果显示，与DMSO空白对照组相比，GSI处理组的miR-342的表达下调至59%（t=19.8,P=0.000），ID4 mRNA表达水平上调至189%（t=27.4,P=0.001）；GSI+miR-342 mimics转染组的miR-342的表达仅下调至91%（t=17.2,P=0.001），ID4 mRNA表达水平仅上调至130%（t=25.4,P=0.000），见图 6A；Western blot法检测和灰度结果分析显示GSI处理组相比DMSO空白对照组ID4表达上调至258%（t=8.9,P=0.000），而GSI+miR-342 mimics转染组相比DMSO空白对照组ID4表达仅上调至165%（t=12.7,P=0.001），见图 6B。

A: qRT-PCR results of miR-342 and ID4 expression in Jurkat cells with GSI-mediated NOTCH1 inhibition or miR-342 mimics-transfected Jurkat cells treated with GSI for 24h; B: Western blot results of ID4 protein expression in Jurkat cells with GSI-mediated NOTCH1 inhibition or miR-342 mimics-transfected Jurkat cells treated with GSI for 24h; C: qRT-PCR results of miR-342 and ID4 expression in Jurkat cells with PCDH-ICN-mediated NOTCH1 activation or miR-342 inhibitor-transfected Jurkat cells with PCDH-ICN-mediated NOTCH1 activation; D: Western blot results of ID4 protein expression in Jurkat cells with PCDH-ICN-mediated NOTCH1 activation or miR-342 inhibitor-transfected Jurkat cells with PCDH-ICN-mediated NOTCH1 activation; *: P<0.05 图 6 miR-342介导NOTCH1对ID4 mRNA和蛋白水平表达的负调控作用 Fig. 6 miR-342 mediated negative regulation effect of NOTCH1 on ID4 mRNA and protein expression

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将miR-342 inhibitor分别转染上述已转染PCDH和PCDH-ICN的Jurkat细胞48 h，检测PCDH对照组、PCDH-ICN组和PCDH-ICN+miR-342 inhibitor转染组的细胞中miR-342的表达和ID4的mRNA及蛋白表达水平。qRT-PCR结果显示，与PCDH对照组相比，PCDH-ICN组的miR-342的表达上调至204%（t=29.4,P=0.001），ID4 mRNA表达水平下调至40%（t=31.7,P=0.000）；PCDH-ICN+miR-342 inhibitor转染组的miR-342的表达仅上调至126%（t=16.9,P=0.000），ID4 mRNA表达水平仅下调至71%（t=24.3,P=0.000），见图 6C；Western blot法检测和灰度结果分析显示PCDH-ICN组相比PCDH对照组ID4表达下调至42%（t=10.6,P=0.001），而PCDH-ICN+miR-342 inhibitor转染组相比PCDH对照组ID4表达仅下调至61%（t=13.7,P=0.000），见图 6D。

大部分T-ALL患者都会发生NOTCH信号通路的激活突变，这表明异常激活的NOTCH信号通路在该病的发生中发挥了重要作用。NOTCH信号通路通过调节靶基因的表达来调节致癌或抑癌基因信号，而且有研究表明microRNAs （miRNAs）也参与了NOTCH调节靶基因表达的过程^{[15, 16]}。因此针对介导NOTCH调控靶基因的miRNA的深入探索，对于揭示T-ALL发生的分子机制和研究抗T-ALL药物靶点有重要意义。

本研究发现了ID4在T-ALL患者中低表达，并且NOTCH1负调控ID4。通过生物信息学方法发现miR-342直接靶向ID4，接着通过构建双荧光素酶报告系统验证了miR-342特异结合ID4 3’-UTR区域调控基因表达，上调miR-342后mRNA和蛋白水平检测ID4显著下调，下调miR-342后mRNA和蛋白水平检测ID4显著上调。结合李三中^[17]报道的基因芯片结果，即以构建特异性NOTCH阻断小鼠为基础，通过高通量筛选出miR-342是NOTCH信号下游的microRNA之一，我们推测在T-ALL中，NOTCH1信号通路可能参与了miR-342的调控。

本实验证实了上面的推测，在T-ALL中阻断NOTCH1信号通路后，与对照组相比，miR-342表达下调，ID4 mRNA和蛋白水平均上调；激活NOTCH1信号通路后，与对照组相比，miR-342表达上调，ID4 mRNA和蛋白水平均下调，这说明NOTCH1信号通路在T-ALL中可激活 miR-342的表达。综上所述，本研究证明了NOTCH1通过激活miR-342对ID4的负调控作用从而下调抑癌基因ID4的表达，促进T-ALL的发生。并可以进一步推测，miR-342的表达高低对T-ALL的发生具有重要影响，miR-342可能作为新的生物学标志用于肿瘤诊断，其促进T-ALL发生的特性，为抗T-ALL新药的研发提供理论基础。

miR-342在多种肿瘤中被证实为肿瘤相关miRNA，可以影响不同的肿瘤细胞的生长、转移或耐药等。Xie等^[18]报道了miR-342通过调控RAP2B参与非小细胞肺癌细胞系的生长和侵袭；在宫颈癌中，也有报道miR-342通过靶向FOXM1抑制宫颈癌细胞的生长、转移和侵袭^[19]；He等^[20]发现了miR-342能通过调控雌激素受体参与到乳腺癌的化疗耐药过程。由于miRNA和其靶基因作用关系网络复杂，一个miRNA可以调控多个靶基因，一个靶基因可以被多个miRNA调控，形成复杂的反馈调节关系，因此推测miR-342不仅可以介导NOTCH1调控ID4从而下调抑癌基因ID4的表达的过程，还有可能通过其他的作用靶点来影响T-ALL细胞的生长、耐药等恶性生物学行为。如何更全面地阐明与T-ALL相关的miRNA在T-ALL发生发展中的作用和介导NOTCH1调 控 靶基因复杂的调控网络，仍需进一步探索。