文章信息
- 贾存东,李晓波,李艳红,梁莉萍,白靖平. 2015.
- JIA Cundong, LI Xiaobo, LI Yanhong, LIANG Liping, BAI Jingping. 2015.
- 弥漫性大B细胞淋巴瘤中mTOR与MRP1的表达及相关性分析
- Correlation of mTOR and MRP1 Expression in Patients with Diffuse Large B-cell Lymphoma
- 肿瘤防治研究, 2015, 42(09): 900-904
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42(09): 900-904
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2015.09.009
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文章历史
- 收稿日期:2014-09-19
- 修回日期:2015-01-23
2. 830011 乌鲁木齐,中国科学院新疆理化技术研究所;
3. 830011 乌鲁木齐,新疆医科大学附属肿瘤医院病理科;
4. 830011 乌鲁木齐,新疆医科大学附属肿瘤医院骨肿瘤科
2. Xinjiang Technical Institute of Physics&Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China;
3. Department of Pathology, Affiliated Tumor Hospital,Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China;
4. Department of Bone Oncology, Affiliated Tumor Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non- Hodgkin's lymphoma,NHL)最常见的病理亚型之一。虽然多数DLBCL患者可获得治愈,但仍有30%~40%患者死于疾病进展与复发,研究提示多药耐药(multi-drug resistance,MDR)相关蛋白1(multidrug resistance protein 1,MRP1)在DLBCL的进展与复发过程中起着重要作用[1, 2],但其调控机制目前尚不清楚。最近研究表明,雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在DLBCL中存在着异常表达[2, 3],并可能与其耐药机制相关,但尚不明了mTOR与MRP1在DLBCL中的相关性,为此本研究检测了109例DLBCL患者mTOR与MRP1 mRNA的表达,结果报道如下。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集2010年1月—2013年6月间确诊的新疆汉族及维吾尔族DLBCL患者共109例。按WHO(2008年)淋巴瘤分类标准,所有病例均经组织形态学和免疫组织化学分析明确诊断为DLBCL。109例患者中,汉族49例、维吾尔族60例;男67例、女42例,男女比例为1.6:1;确诊时中位年龄52岁(17~83岁);按Ann Arbor分期标准,Ⅰ期5例、Ⅱ期51例、Ⅲ期24例、Ⅳ期29例;确诊时病变累及淋巴结及受侵≤1个结外淋巴结患者63例(57.8%)、病变累及≥2个结外部位患者46例(42.2%);确诊时按美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)判定体力状态(performance status)评分,0~1分患者103例(94.5%)、2分者6例(5.5%);18.3%(20/109)的患者血浆乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)高于正常水平;16.5%(18/109)患者伴有B症状;大肿块患者7例(6.4%)。大肿块定义为:胸部X线片肿块最大径>胸腔最大内经的1/3,或在胸椎5~6水平纵隔肿块>胸腔最大内经的35%,或行CT检查显示任何部位的肿块直径≥10 cm,符合上述三者之一者即为大肿块;根据国际预后指数(international prognostic index,IPI):低危组(IPI 0~1)85例、低中危组(IPI 2)12例、中高危组(IPI 3)6例、高危组(IPI 4~5)6例。根据Choi免疫学分型法则[4],生发中心样B细胞(germinal center B-cell like,GCB)型DLBCL与non-GCB 型DLBCL的例数分别为35例与74例。
1.2 试剂TRIzol试剂购自上海Invitrogen公司,RT-PCR试剂盒、TBST、二抗为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔多克隆抗体、内参磷酸甘油醛脱氢(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为单克隆小鼠抗人GAPDH抗体、二抗为HRP标记的山羊抗小鼠多克隆抗体、ECL发光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自美国CWbio公司。
1.3 方法 1.3.1 Western blot法检测p-mTOR的表达将冻存的组织标本蛋白裂解液,置匀浆器中研磨,使之充分匀浆化。冰浴60 min后,以12 000 r/min低温离心15 min,取上清液,用BCA法测上清蛋白浓度,取100 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚偏氟乙烯膜电转移,含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭非特异性抗原,然后分别加入山羊抗兔IgG(1:10 000)及GAPDH小鼠抗人单克隆抗体(1:1 000),4℃孵育过夜,次日用TBST液洗膜3次,每次10 min,加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体(1:10 000)37℃孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,ECL化学发光试剂自显影。
1.3.2 RT-PCR法检测MRP1 mRNA的表达新鲜组织研磨,加入TRIzol溶液,提取RNA,反转录;反转录所得cDNA进行PCR,反应总体积为20 μl,反应体系为cDNA 3 μl、1 mmol/L MRP引物各1 μl(正义:5'- AACCTGGACCCATTCAGCC-3',反义:5'-GACTGGATGAGGTCGTCCGT-3'),1 mmol/L GAPDH引物各1 μl(正义:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3',反义:5'- CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3')作为内对照,反应条件为94℃预变性2 min,然后94℃ 45 s、55℃ 60 s、65℃ 60 s,循环35次,65℃ 10 min终止反应。PCR产物10 μl进行1%的琼脂糖凝胶电泳。
1.4 随访采用门诊随访和电话随访。随访截止日期为2013年12月31日。疾病无进展生存(progression free survival,PFS)时间指治疗之日至病情进展、死亡的时间,以月为单位。
1.5 统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行分析。计数资料用χ2检验;Kaplan-Meier法进行生存分析,Log rank法比较组间生存率。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 p-mTOR、MRP1 mRNA在DLBCL中的表达p-mTOR在DLBCL中的阳性率为58.7%(64/109),p-mTOR的表达在GCB组与non-GCB组DLBCL患者中的阳性率分别为37.1%和68.9%,差异具有统计学意义(P=0.002);但p-mTOR与DLBCL患者的族别、性别、年龄、Ann Arbor分期、B症状、结外病变、LDH水平及IPI无相关性,见表 1、图 1。MRP1 mRNA在全组DLBCL患者中的阳性率为56.9%(62/109),MRP1 mRNA在GCB组与non-GCB组DLBCL患者中的阳性率分别为37.1%和66.2%,两组差异有统计学意义(P=0.004),但MRP1 mRNA与DLBCL患者的族别、性别、年龄、Ann Arbor分期、B症状、结外病变、LDH水平及IPI无相关性(P>0.05),见表 2、图 2。
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1: negative control group; 2, 3, 5: germinal center B-cell like GCB group; 4: non-GCB group 图 1 Western blot检测p-mTOR在DLBCL中的表达 Figure 1 The expression of p-mTOR in DLBCL specimen detected by Western blot |
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1: marker; 2: control group; 3: non-GCB group; 4: GCB group 图 2 RT-PCR检测MRP1在DLBCL中的表达 Figure 2 The expression of MRP1 gene in DLBCL specimen assayed by RT-PCR |
在109例DLBCL患者中,p-mTOR蛋白表达与MRP1基因扩增显著相关(P=0.003),见表 3。
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截至随访日期,中位随访时间为18月(2~52月),疾病进展或死亡患者49例,无复发生存患者60例。p-mTOR表达阳性组、阴性组患者PFS比较具有统计学意义(P=0.001),生存曲线见图 3;MRP1 mRNA扩增阳性组、阴性组患者PFS比较具有统计学意义(P=0.048),生存曲线见图 4。
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图 3 p-mTOR表达阴性DLBCL患者与p-mTOR表达阳性DLBCL患者的生存曲线 Figure 3 Survival curves of DLBCL positive and negative p-mTOR expression |
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图 4 MRP1表达阴性DLBCL患者与MRP1表达阳性DLBCL患者的生存曲线 Figure 4 Survival curves of DLBCL in patients with positive and negative MRP1 expression |
DLBCL虽已进入利妥昔单抗治疗时代,但仍有30%~40%患者死于疾病进展与复发,MDR是DLBCL患者疾病进展与复发的重要因素之一[1, 5]。研究表明MDR的发生与MRP1的产生有关[6, 7],MRP1是1992年由Cole等在耐阿霉素的小细胞肺癌细胞株H69/AR的研究中率先发现,随后在多种耐药的肿瘤细胞中均有表达。Ohsawa等[8]对原发于结内的41例DLBCL患者研究发现,MRP1的阳性表达率为63%,而且MRP1阳性DLBCL患者组中疗效达完全缓解的比例显著低于MRP1阴性DLBCL患者组疗效达完全缓解的比例(32% vs. 69%,P < 0.001),本研究认为MRP1是DLBCL患者疗效及预后评价的重要预测因子。本研究结果显示,MRP1 mRNA在全组DLBCL患者的阳性率为56.9%,MRP1在non-GCB组中的表达高于其在GCB组中的表达,而有研究提示DLBCL患者中non-GCB组与GCB组相比有较高的复发率及较差的预后[9, 10],推测non-GCB组具有较高的复发率可能与non-GCB组中存在较高的MRP1表达有关。本研究进一步分析表明MRP1的表达与DLBCL患者的PFS相关,MRP1表达阳性的患者较易复发,提示MRP1参与了DLBCL的复发与耐药,因此阐明MRP1的调控对于克服DLBCL的复发与耐药具有重要意义。
目前MRP1在DLBCL患者中的调控机制目前知之甚少。最近研究提示,PI3K/Akt/mTOR信号转导通路与肿瘤的增殖、凋亡、异常血管生成、细胞周期及多药耐药等重要的生物学行为密切相关,其详细机制仍有待深入研究。本研究结果显示,p-mTOR在DLBCL患者中的表达率为58.7%,国内于宝华等[11]用免疫组织化学法检测100例DLBCL患者新鲜组织中p-mTOR的表达,结果显示p-mTOR在DLBCL患者中的阳性率为75.0%(75/100),本研究p-mTOR的表达率低于于宝华等研究结果原因可能与样本的选择、检测方法不同有关。越来越多的研究表明不同细胞起源的DLBCL其信号转导机制不同,Zang等[12]进一步研究发现,使用同时抑制PI3K与mTOR活性的NVP-BEZ235可显著诱导GCB型DLBCL肿瘤细胞的死亡,而在non-GCB型DLBCL肿瘤细胞系中,由于受到NF-κB或Pim激酶介导的信号补偿作用,NVP-BEZ235的作用并不显著,表明PI3K/Akt/mTOR在DLBCL不同免疫学亚型中的作用并不完全一致。于宝华等进一步分析显示,non-GCB型DLBCL中p-mTOR的阳性率为84.2%(48/57),高于GCB型中的阳性比8/18和8/18(P < 0.01),本研究认为,AKt/mTOR信号转导通路活化在DLBCL的发生中起重要作用,并有望成为部分DLBCL治疗的新靶点。本研究结果与于宝华等研究结果基本一致,提示mTOR信号转导通路参与了DLBCL不同免疫学亚型的发病。前已述及MRP1表达阳性的DLBCL患者具有较差的PFS,进一步的相关分析显示,mTOR的表达与MRP1的表达存在相关性,提示mTOR可能参与了MRP1 mRNA的调控。江雪杰等[13]研究发现,通过采用mTOR抑制剂RAD001对急性髓细胞白血病HL60/ADM细胞株研究发现,RAD001能够通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导活性来抑制P53依赖的MRP1表达从而逆转白血病HL60/ADM细胞株的耐药。因此通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导来逆转DLBCL肿瘤细胞的耐药、增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感度可能是一个有效的措施。
综上所述,mTOR与MRP1参与了DLBCL不同免疫学亚型的发病及其复发,mTOR信号转导通路可能参与了MRP1的调控,但需进一步的研究证实。
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