弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（Non- Hodgkin's lymphoma，NHL）最常见的病理亚型之一。虽然多数DLBCL患者可获得治愈，但仍有30%~40%患者死于疾病进展与复发，研究提示多药耐药（multi-drug resistance,MDR）相关蛋白1（multidrug resistance protein 1,MRP1）在DLBCL的进展与复发过程中起着重要作用^{[1, 2]}，但其调控机制目前尚不清楚。最近研究表明，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）在DLBCL中存在着异常表达^{[2, 3]}，并可能与其耐药机制相关，但尚不明了mTOR与MRP1在DLBCL中的相关性，为此本研究检测了109例DLBCL患者mTOR与MRP1 mRNA的表达，结果报道如下。

收集2010年1月—2013年6月间确诊的新疆汉族及维吾尔族DLBCL患者共109例。按WHO（2008年）淋巴瘤分类标准，所有病例均经组织形态学和免疫组织化学分析明确诊断为DLBCL。109例患者中，汉族49例、维吾尔族60例；男67例、女42例，男女比例为1.6:1；确诊时中位年龄52岁（17~83岁）；按Ann Arbor分期标准，Ⅰ期5例、Ⅱ期51例、Ⅲ期24例、Ⅳ期29例；确诊时病变累及淋巴结及受侵≤1个结外淋巴结患者63例（57.8%）、病变累及≥2个结外部位患者46例（42.2%）；确诊时按美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG）判定体力状态（performance status）评分，0~1分患者103例（94.5%）、2分者6例（5.5%）；18.3%（20/109）的患者血浆乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）高于正常水平；16.5%（18/109）患者伴有B症状；大肿块患者7例（6.4%）。大肿块定义为：胸部X线片肿块最大径>胸腔最大内经的1/3，或在胸椎5~6水平纵隔肿块>胸腔最大内经的35%，或行CT检查显示任何部位的肿块直径≥10 cm，符合上述三者之一者即为大肿块；根据国际预后指数（international prognostic index,IPI）：低危组（IPI 0~1）85例、低中危组（IPI 2）12例、中高危组（IPI 3）6例、高危组（IPI 4~5）6例。根据Choi免疫学分型法则^[4]，生发中心样B细胞（germinal center B-cell like，GCB）型DLBCL与non-GCB 型DLBCL的例数分别为35例与74例。

TRIzol试剂购自上海Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒、TBST、二抗为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的山羊抗兔多克隆抗体、内参磷酸甘油醛脱氢（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）为单克隆小鼠抗人GAPDH抗体、二抗为HRP标记的山羊抗小鼠多克隆抗体、ECL发光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自美国CWbio公司。

将冻存的组织标本蛋白裂解液，置匀浆器中研磨，使之充分匀浆化。冰浴60 min后，以12 000 r/min低温离心15 min，取上清液，用BCA法测上清蛋白浓度，取100 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚偏氟乙烯膜电转移，含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭非特异性抗原，然后分别加入山羊抗兔IgG（1:10 000）及GAPDH小鼠抗人单克隆抗体（1:1 000），4℃孵育过夜，次日用TBST液洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体（1:10 000）37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光试剂自显影。

新鲜组织研磨，加入TRIzol溶液，提取RNA，反转录；反转录所得cDNA进行PCR，反应总体积为20 μl，反应体系为cDNA 3 μl、1 mmol/L MRP引物各1 μl（正义：5'- AACCTGGACCCATTCAGCC-3'，反义：5'-GACTGGATGAGGTCGTCCGT-3'），1 mmol/L GAPDH引物各1 μl（正义：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反义：5'- CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'）作为内对照，反应条件为94℃预变性2 min，然后94℃ 45 s、55℃ 60 s、65℃ 60 s，循环35次，65℃ 10 min终止反应。PCR产物10 μl进行1%的琼脂糖凝胶电泳。

采用门诊随访和电话随访。随访截止日期为2013年12月31日。疾病无进展生存（progression free survival,PFS）时间指治疗之日至病情进展、死亡的时间，以月为单位。

采用SPSS16.0统计软件进行分析。计数资料用χ²检验；Kaplan-Meier法进行生存分析，Log rank法比较组间生存率。P＜0.05为差异有统计学意义。

p-mTOR在DLBCL中的阳性率为58.7%（64/109），p-mTOR的表达在GCB组与non-GCB组DLBCL患者中的阳性率分别为37.1%和68.9%，差异具有统计学意义（P=0.002）；但p-mTOR与DLBCL患者的族别、性别、年龄、Ann Arbor分期、B症状、结外病变、LDH水平及IPI无相关性，见表 1、图 1。MRP1 mRNA在全组DLBCL患者中的阳性率为56.9%（62/109），MRP1 mRNA在GCB组与non-GCB组DLBCL患者中的阳性率分别为37.1%和66.2%，两组差异有统计学意义（P=0.004），但MRP1 mRNA与DLBCL患者的族别、性别、年龄、Ann Arbor分期、B症状、结外病变、LDH水平及IPI无相关性（P>0.05），见表 2、图 2。

表 1 mTOR的表达及与DLBCL患者临床特征的相关性 Table 1 Correlation between mTOR expression with clinical characteristics of DLBCL patients

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1: negative control group; 2, 3, 5: germinal center B-cell like GCB group; 4: non-GCB group 图 1 Western blot检测p-mTOR在DLBCL中的表达 Figure 1 The expression of p-mTOR in DLBCL specimen detected by Western blot

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表 2 MRP1的表达及与DLBCL患者临床特征的相关性 Table 2 Correlation between of MRP1 expression with clinical characteristics of DLBCL patients

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1: marker; 2: control group; 3: non-GCB group; 4: GCB group 图 2 RT-PCR检测MRP1在DLBCL中的表达 Figure 2 The expression of MRP1 gene in DLBCL specimen assayed by RT-PCR

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在109例DLBCL患者中，p-mTOR蛋白表达与MRP1基因扩增显著相关（P=0.003），见表 3。

表 3 109例DLBCL患者p-mTOR与MRP1表达的相关性分析 Table 3 Correlation between expression of p-mTOR with expression of MRP1 109 in DLBCL patients

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截至随访日期，中位随访时间为18月（2~52月），疾病进展或死亡患者49例，无复发生存患者60例。p-mTOR表达阳性组、阴性组患者PFS比较具有统计学意义（P=0.001），生存曲线见图 3；MRP1 mRNA扩增阳性组、阴性组患者PFS比较具有统计学意义（P=0.048），生存曲线见图 4。

图 3 p-mTOR表达阴性DLBCL患者与p-mTOR表达阳性DLBCL患者的生存曲线 Figure 3 Survival curves of DLBCL positive and negative p-mTOR expression

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图 4 MRP1表达阴性DLBCL患者与MRP1表达阳性DLBCL患者的生存曲线 Figure 4 Survival curves of DLBCL in patients with positive and negative MRP1 expression

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DLBCL虽已进入利妥昔单抗治疗时代，但仍有30%~40%患者死于疾病进展与复发，MDR是DLBCL患者疾病进展与复发的重要因素之一^{[1, 5]}。研究表明MDR的发生与MRP1的产生有关^{[6, 7]}，MRP1是1992年由Cole等在耐阿霉素的小细胞肺癌细胞株H69/AR的研究中率先发现，随后在多种耐药的肿瘤细胞中均有表达。Ohsawa等^[8]对原发于结内的41例DLBCL患者研究发现，MRP1的阳性表达率为63%，而且MRP1阳性DLBCL患者组中疗效达完全缓解的比例显著低于MRP1阴性DLBCL患者组疗效达完全缓解的比例（32% vs. 69%,P < 0.001），本研究认为MRP1是DLBCL患者疗效及预后评价的重要预测因子。本研究结果显示，MRP1 mRNA在全组DLBCL患者的阳性率为56.9%，MRP1在non-GCB组中的表达高于其在GCB组中的表达，而有研究提示DLBCL患者中non-GCB组与GCB组相比有较高的复发率及较差的预后^{[9, 10]}，推测non-GCB组具有较高的复发率可能与non-GCB组中存在较高的MRP1表达有关。本研究进一步分析表明MRP1的表达与DLBCL患者的PFS相关，MRP1表达阳性的患者较易复发，提示MRP1参与了DLBCL的复发与耐药，因此阐明MRP1的调控对于克服DLBCL的复发与耐药具有重要意义。

目前MRP1在DLBCL患者中的调控机制目前知之甚少。最近研究提示，PI3K/Akt/mTOR信号转导通路与肿瘤的增殖、凋亡、异常血管生成、细胞周期及多药耐药等重要的生物学行为密切相关，其详细机制仍有待深入研究。本研究结果显示，p-mTOR在DLBCL患者中的表达率为58.7%，国内于宝华等^[11]用免疫组织化学法检测100例DLBCL患者新鲜组织中p-mTOR的表达，结果显示p-mTOR在DLBCL患者中的阳性率为75.0%（75/100），本研究p-mTOR的表达率低于于宝华等研究结果原因可能与样本的选择、检测方法不同有关。越来越多的研究表明不同细胞起源的DLBCL其信号转导机制不同，Zang等^[12]进一步研究发现，使用同时抑制PI3K与mTOR活性的NVP-BEZ235可显著诱导GCB型DLBCL肿瘤细胞的死亡，而在non-GCB型DLBCL肿瘤细胞系中，由于受到NF-κB或Pim激酶介导的信号补偿作用，NVP-BEZ235的作用并不显著，表明PI3K/Akt/mTOR在DLBCL不同免疫学亚型中的作用并不完全一致。于宝华等进一步分析显示，non-GCB型DLBCL中p-mTOR的阳性率为84.2%（48/57），高于GCB型中的阳性比8/18和8/18（P < 0.01），本研究认为，AKt/mTOR信号转导通路活化在DLBCL的发生中起重要作用，并有望成为部分DLBCL治疗的新靶点。本研究结果与于宝华等研究结果基本一致，提示mTOR信号转导通路参与了DLBCL不同免疫学亚型的发病。前已述及MRP1表达阳性的DLBCL患者具有较差的PFS，进一步的相关分析显示，mTOR的表达与MRP1的表达存在相关性，提示mTOR可能参与了MRP1 mRNA的调控。江雪杰等^[13]研究发现，通过采用mTOR抑制剂RAD001对急性髓细胞白血病HL60/ADM细胞株研究发现，RAD001能够通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导活性来抑制P53依赖的MRP1表达从而逆转白血病HL60/ADM细胞株的耐药。因此通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导来逆转DLBCL肿瘤细胞的耐药、增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感度可能是一个有效的措施。

综上所述，mTOR与MRP1参与了DLBCL不同免疫学亚型的发病及其复发，mTOR信号转导通路可能参与了MRP1的调控，但需进一步的研究证实。