结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率与死亡率有逐年上升的趋势，严重危害人们的健康与生命。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是内源性的非编码小RNA，对基因表达进行转录后的负向调控，大量研究证明miRNA与多种肿瘤的发生发展存在密切关系。miR-21在多种肿瘤中的表达均出现显著异常，揭示它作为一个致癌miRNA，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。多项研究表明miR-21在大肠癌组织中表达上调，恶性程度越高的癌组织中表达量越高。孙建斌等^[1]研究发现大肠癌组与良性大肠疾病组和健康对照组血浆miR-21表达差异具有统计学意义。国外多项研究提示^{[2, 3]}结肠癌患者组织中miR-21高表达，与临床分期、淋巴结转移及远处转移相关。本实验用实时荧光定量方法对结肠癌患者术前一周、术后一周、术后一月血浆中miR-21表达进行动态检测，并观察其表达与肿瘤的分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移是否有关系。本研究旨在揭示结肠癌患者血浆中miR-21的表达情况，提示其检测可成为有效的辅助诊断结肠癌及判断其预后的分子标志。

收集株洲市中心医院和湘雅医院经病理诊断为结肠癌的40例患者临床资料，术前均未接受过放化疗及细胞分子靶向治疗。其中男23例、女17例；年龄30~80岁（平均年龄56.14岁）。高分化腺癌10例、中分化16例、低分化14例；TNM分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期18例、Ⅲ期11例、Ⅳ期5例；有淋巴结转移24例、无淋巴结转移16例；远处转移5例、无远处转移35例。另采集20例健康志愿者外周血标本作为阴性对照。血液标本的采集均获得患者及健康志愿者的知情同意。

抽取20例健康志愿者和40例结肠癌患者手术前一周清晨空腹时外周静脉血5 ml，手术后一周和一月后再次抽取，抽取后加入EDTA抗凝剂，在常温下4 h内处理。血标本在4℃下1 200 g离心10 min，用1.5 ml无核糖核酸酶（RNa酶）的离心管分装血浆和血细胞，-80℃冰箱保存备用。

每份血标本取400 μl血浆移至另一干净的1.5 ml EP管中，提取RNA前再次离心，离心条件：1 200 g，4℃ 10 min。收集血浆至另一新的EP管中。加入TRIzol试剂，与管中血浆的比例为1:0.8（V:V）。充分混匀，放置冰上15 min，1 200 g，4℃离心10 min，取上清液。用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。

检测方法为荧光定量PCR法，利用两步法对miR-21进行检测，按照上海吉玛制药技术有限公司Hairpin-itTM miRNAs qPCRQuantitationKit试剂盒说明进行反转录反应。荧光定量PCR，对目的miRNAs使用一般通用的反转录条件进行转录。95℃ 30 s、95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 20 s ，循环40次，所有标本检测3次，扩增U6作为内参基因。

采用SPSS15.0统计软件进行处理。用2^-ΔΔCt表示miR-21的表达量，表达水平用（x±s）表示。术前、术后一周、术后一月miR-21的表达水平采用配对t检验，miR-21与结肠癌临床病理特征之间的相关性采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

qRT-PCR检测结果显示40例结肠癌患者术前血浆中miR-21的表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表 1。

表 1 结肠癌患者与健康对照组血浆中miR-21的表达水平分析 (x±s) Table 1 Plasma miR-21 expression in colon cancer patients and healthy controls (x±s)

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qRT-PCR检测miR-21在40例结肠癌患者手术前一周、手术后一周和术后一月血浆中的表达，结果显示与术前相比，术后一周和一月血浆中miR-21的表达明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），见表 2。miR-21的下降水平以手术后第一周最为明显，术后一周至术后一月下降较缓慢。

表 2 miR-21在术前一周、术后一周和术后一月相对表达值配对比较分析 (n=40) Table 2 Comparison of miR-21 expression one week before operation,one week and one month after operation (n=40)

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qRT-PCR检测miR-21在40例结肠癌患者手术前一周的表达与肿瘤的分化程度、临床分期、淋巴结转移及远处转移有关，而与年龄、性别无相关性，见表 3。

表 3 miR-21的表达与各临床病理参数的关系 Table 3 Relationship between miR-21 expression and clinicopathological parameters

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微小RNA（miRNA）是一类进化上保守、内源性非蛋白质编码的RNA分子，长约17~25个核苷酸，能够识别特定的目标mRNA，并在转录后水平负调控基因^[4]。近年来miRNA的研究已成为肿瘤学诊断和治疗领域的新热点。miR-21基因是最早在人类基因组中检测到的miRNA基因之一，其在肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、肝癌、胆管癌、结肠癌、前列腺癌中均呈过表达^{[5, 6, 7, 8]}，是实体肿瘤中最常见的过高表达miRNA之一，在肿瘤的发生发展中可能发挥癌基因的作用^[9]。

外周血循环肿瘤标志物的检测具有微创伤、可重复、可在同一时间点进行多项指标检测等优点，是肿瘤诊断和随访的理想方法。目前研究已证实miR-21不仅在结肠癌组织呈高表达，在患者血浆中也呈高表达，并与临床分期和预后密切相关^{[1, 10, 11]}。研究发现血浆miR-21在大肠癌诊断的敏感度和特异性分别为84.5%和74.4%^[12]，因此血浆miR-21可能作为一个潜在的广谱的结肠癌检测的生物标志物，成为结肠癌诊断的一种新方法。

本研究对结肠癌患者血浆中miR-21表达情况进行术前和术后动态检测，结果发现在结肠癌患者手术后血浆中miR-21的表达明显降低，差异有统计学意义。即手术去除肿瘤后，血浆中miR-21水平迅速下降。说明miR-21与肿瘤密切相关，它能促进肿瘤的发生、增殖。

综上所述，qRT-PCR检测结肠癌患者血浆中miR-21的表达对监测其发展、判断其分期、手术效果、复发和转移具有重要作用。血浆miR-21表达可作为结肠癌潜在的生物标志物，有效的辅助诊断结肠癌及判断其预后。