卵巢癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率占妇科肿瘤之首^[1]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases,MAPK）和蛋白激酶B（kinaseB,AKT）信号通路广泛存在于哺乳动物细胞内，该类通路活化可促进肿瘤细胞的增殖，并参与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的降解等过程^[2]。研究表明ECM降解及基底膜的破坏是肿瘤浸润、转移的必要条件^[2]，在结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-typeplasminogen activator,uPA）参与ECM的降解^{[3, 4]}，在肿瘤恶性转化过程中发挥重要作用。研究发现多种肿瘤细胞及组织中MAPK、AKT信号转导通路被激活^[5]，但具体机制尚不清楚，且有关此类信号通路与uPA之间相关性方面的研究较少。本研究检测49例卵巢癌组织中P38MAPK、细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）、AKT及uPA蛋白的表达，并进一步验证HO8910、HO-8910PM细胞系中P38MAPK、uPA蛋白的表达，探讨卵巢癌细胞及组织中MAPK、AKT信号通路与uPA蛋白的相关性，以期指导临床。

收集胜利油田中心医院病理科2007年3月—2014年3月手术切除的卵巢癌组织49例，所有患者术前均未经任何治疗，年龄28~67岁，平均年龄42岁，其中浆液性囊腺癌26例，黏液性囊腺癌15，其他类型8例，标本SP染色。按照国际妇产科联盟（International Federation ofGynecology and Obsteterics,FIGO）2000年分期标准进行分期：Ⅰ~Ⅱ期19例，Ⅲ~Ⅳ期30例。对照组为10例正常卵巢组织，见表 1。

表 1 uPA、P38MAPK在卵巢癌组织中的表达与临床病理特征的关系 Table 1 Relationship between uPA and P38MAPK expression and clinicopathological features in ovarian cancer tissues

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人卵巢癌细胞系HO8910、HO-8910PM由胜利油田中心医院实验室保存复苏，细胞分别在37℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI1640和DMEM培养液中培养、传代。

DMEM及RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；鼠抗人P38MAPK、uPA、ERK、AKT单克隆抗体均购自美国Cell signaling公司；uPA多克隆抗体购自武汉博士德公司；二抗及β-actin多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

按照试剂盒说明书步骤，常规脱蜡水化、抗原修复、敷一抗、显色、复染。设正常卵巢组织为对照组，实验重复3遍。

不同浓度的SB203580（0、2、5、10 μmol/L）处理HO8910、HO-8910PM细胞系24 h，提取蛋白，标准化蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，转PDVF膜，牛奶封闭，4℃敷一抗，室温敷二抗，显色。实验重复3遍。

根据阳性细胞的比率和染色深度进行评估。以肿瘤细胞中出现黄色及棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＜10%为0分；10%~≤25%为1分；25%~50%为2分；＞50%为3分。染色深度评分：无染色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分，棕黄色为3分。总分等于阳性细胞比率与染色深度评分之和。1~2分为弱阳性（+），3~4分为中强阳性（++），5~6分为强阳性（+++）。

采用SPSS17.0统计软件处理数据，用χ²检验、等级相关分析法、Log rank检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

免疫组织化学结果显示：uPA、P38MAPK蛋白分别表达于卵巢癌细胞质、胞核中，呈棕黄色颗粒，阳性率分别为61.22%、57.14%；AKT、ERK蛋白主要位于胞质，部分位于胞核，其阳性率分别为53.06%、55.10%。等级相关分析示uPA与P38MAPK蛋白表达呈正相关（r=0.8645，P=0.001），而与AKT、ERK蛋白表达无明显相关性（r=0.083,0.174; P=0.560,0.257），见图 1、表 2。

A: positive expression of uPA in ovarian cancer tissues(SP ×100); B: expression of uPA in normal ovarian tissues(SP ×100); C: positive expression of P38MAPK in ovarian cancer tissues(SP ×40); D: expression of P38MAPK in normal ovarian tissues(SP ×100); E: positive expression of AKT in ovarian cancer tissues(SP ×100); F: expression of AKT in normal ovarian tissues(SP ×40); G: positive expression of ERK in ovarian cancer tissues(SP ×100); H: expression of ERK in normal ovarian tissues(SP ×40) 图 1 uPA、P38MAPK、AKT、ERK分别在卵巢癌组织(ACEG)和正常组织(BDFH)中的表达 Figure 1 Expression of uPA,P38MAPK,AKT,ERK in ovarian cancer and normal ovarian tissues

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表 2 卵巢癌组织中uPA与P38MAPK、ERK、AKT之间的相关性 Table 2 Correlation between uPA and P38MAPK,ERK,AKT expression in ovarian cancer tissues

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uPA和P38MAPK蛋白的表达与卵巢癌组织的临床分期、分化程度、淋巴结转移、大网膜转移有关，而与患者的年龄、组织学类型无明显相关性。ERK、AKT蛋白表达与卵巢癌淋巴结转移、大网膜转移有关，而与患者的年龄、组织类型、分化程度、临床分期无明显相关性，见表 1。

Western blot结果显示，高转移性HO-8910PM细胞中P38MAPK及uPA蛋白表达明显高于低转移性的HO8910细胞，见图 2。

图 2 卵巢癌细胞系HO8910和HO-8910PM中uPA及P38MAPK蛋白表达 Figure 2 uPA and P38MAPK expression in ovarian cancer cell lines HO8910 and HO-8910PM

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用不同浓度的 SB203580（0、2、5、10 μmol/L）处理细胞24 h，Western blot检测显示，卵巢癌细胞HO-8910PM中uPA蛋白表达水平下降，且表达水平随着SB203580浓度升高而下降，见图 3。

1: control group; 2: SB203580 2μmol/L; 3:SB203580 5μmol/L; 4: SB203580 10μmol/L 图 3 SB203580处理卵巢癌细胞系HO-8910PM 24h后uPA 蛋白的表达变化 Figure 3 Change of uPA expression in ovarian cancer cell lines HO-8910PM treated with SB203580 for 24h

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对49例卵巢癌患者进行36~60月的跟踪随访，30例uPA阳性者死亡率为63.33%，19例uPA阴性者死亡率为36.84%；28例P38MAPK蛋白表达阳性者死亡率为60.71%，21例P38MAPK蛋白表达阴性者死亡率为42.86%。绘制Kaplan-Meier生存曲线并进行Log rank检验，结果表明uPA、P38MAPK蛋白表达与术后生存率呈负相关（r=3.897,11.044；P=0.048,0.001），见图 4、图 5。

图 4 uPA蛋白表达与患者术后生存率的关系 Figure 4 Relationship between uPA expression and postoperative survival rate of ovarian cancer patients

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图 5 P38MAPK蛋白表达与患者术后生存率的关系 Figure 5 Relationship between P38MAPK expression and postoperative survival rate of ovarian cancer patients

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卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，极易发生扩散和转移^[1]。uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，主要通过与uPAR结合，参与生理、病理条件下细胞分化、迁移、组织重建及ECM降解、刺激血管形成等过程^[6]。研究表明纤溶酶可激活胶原蛋白酶原、水解胶原纤维，使细胞发生迁移，从而降解肿瘤中的ECM及基底膜；可激活proMMP-9以及胶原的降解；还可以增加血管内皮生长因子（VEGF）的活性刺激血管生成^[7]。同样，卵巢癌浸润、转移过程中也发生ECM及基底膜的降解。uPA在不同卵巢癌组织中均有表达，但其具体作用机制尚不清楚，有关uPA的表达与信号通路的关系研究较少。本研究检测了49例卵巢癌组织中uPA表达水平，结果显示uPA在卵巢癌组织中高表达，且与其分化、转移程度有关，提示uPA所激活的纤溶系统在卵巢癌发生、发展过程中起重要作用。

细胞内信号转导通路与多种肿瘤发生、发展及转移密切相关。MAPK信号通路主要有三种途径：ERK通路；C-JunN2末端激酶（JUK）通路；P38通路。JUK信号通路可被多种细胞外应急信号激活，在应急反应中起重要作用。AKT、P38及ERK信号通路则主要参与调节肿瘤细胞的增殖、转移、黏附、肿瘤血管生成以及ECM的降解等过程^[8]。AKT、ERK信号通路与卵巢癌的发生密切相关，有报道称80%的早期卵巢癌细胞和上皮性卵巢癌中该信号通路被激活^{[9, 10]}，但具体机制尚不明确。有研究证实，乳腺癌组织中P38MAPK信号通路被激活^[11]，而宫颈癌组织中P38MAPK信号通路可通过调控uPA的表达抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移^[12]。但有关卵巢癌中uPA蛋白与MAPK、AKT信号通路相关性的研究报道较少，本研究采用免疫组织化学技术检测了49例卵巢癌组织中uPA、P38MAPK、ERK及AKT蛋白的表达，结果显示uPA与P38MAPK的表达成正相关，推测uPA、P38MAPK的表达可能与卵巢癌的恶性进展、侵袭转移有关。P38MAPK信号通路上调uPA的表达，通过降解ECM参与卵巢癌的侵袭、转移。本研究又发现uPA、AKT、ERK蛋白三者之间无明显相关性，提示AKT及ERK信号通路并不参与uPA蛋白表达的调控。

为进一步验证P38MAPK信号通路参与uPA的表达调控，本实验采用Western blot方法检测HO8910、HO-8910PM细胞系中uPA、P38MAPK蛋白的表达以及P38MAPK通路特异性阻断剂SB203580作用后二者的变化，结果显示SB203580以浓度依赖的方式降低uPA的表达，证明卵巢癌细胞中P38MAPK信号通路参与uPA表达。有研究证实了uPA基因启动子区有AP-1、SP-1等转录因子结合位点，P38MAPK信号通路活化可增强ATF-2转录因子的活性，而ATF-2可激活AP-1^[13]。我们推测P38MAPK信号通路也可能通过活化转录因子AP-1引起uPA基因转录增强，uPA蛋白表达增多，从而促进卵巢癌的侵袭、转移。

综上所述，P38MAPK信号通路可能通过上调uPA的表达，促进卵巢癌的恶性进展及侵袭转移，但其具体作用位点尚不清楚。uPA、P38MAPK有望为卵巢癌早期诊断、评估预后提供依据，可能为肿瘤治疗开辟一条新途径。