肿瘤患者血液中循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)的存在是由Thomas Ashworth于1869年首次提出的^[1]。CTCs是指从原发或继发肿瘤脱落进入外周血循环的肿瘤细胞,与原发肿瘤具有相似的抗原和(或)遗传特性^[2]。这些细胞对更好理解肿瘤生物学以及肿瘤细胞播散有重要的意义,其分子特征对更好理解转移的生物学以及治疗的耐药性具有特殊的潜力^{[3, 4]}。尽管许多研究表明CTCs具有潜在的预后价值,但到目前为止,对其的评估仍没有影响到治疗策略。人们普遍认为对CTCs的评估能使早期癌症获益,尤其是在那些早期进展及缺乏预后标志物的肿瘤类型中,其中非肌肉浸润性膀胱癌是很好的例子。实际上,这种位置较浅表及分期较早的肿瘤转移率可达20%~40%,这与隐匿性转移灶的出现不无关系。因此,CTCs也许可以作为早期膀胱癌患者判断预后的一种非侵袭性、实时监测的工具。

当癌症在早期被诊断,通常被认为是局限性疾病并接受相应的治疗。然而,一些分期较早肿瘤的自然史证实这些早期肿瘤并不像其看上去这样早。大部分早期膀胱癌患者数据表明:局限于黏膜(Ta)或黏膜下层(T1)的膀胱癌复发率>50%,一些非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC),尤其是T1G3型患者,虽然其生物学特征表现为非侵袭性,但经保留膀胱综合治疗后5年内癌症相关死亡率为16%~23%,10年内复发进展或死亡率为75%^[5]。所以NMIBC在临床上和生物学特性上表现出明显的相悖性。相似的是,乳腺癌患者在接受原发肿瘤根治性切除20年后出现复发,这就引起了肿瘤细胞可能长期休眠以至于目前利用影像方法都不可检测,直至肿瘤进展的假说,可以想象这些假设的早期癌症实际上从一开始就有微转移发生。鉴于这一点,我们就怀疑早期癌症的真实意义。越来越多的证据表明单个肿瘤的个体化分子特征阻碍了早期"这一术语定义的概念化。为了加深对微转移概念的理解,一种新的M分期-cM0(i+)引入到乳腺癌AJCC分期系统,其被定义为没有远处转移的临床或影像学证据,但血液、骨髓或直径不大于0.2 mm的非局部淋巴结组织中存储着通过分子学或显微镜发现的肿瘤细胞^[6]。微转移的概念表明,癌细胞从原发灶脱落到出现临床症状需要在体内循环很长时间。骨髓、淋巴结以及外周血中所检测到的肿瘤细胞可作为疾病早期转移的代名词。这些漂浮的肿瘤细胞即CTCs^[7]。如果将CTCs作为微转移的代名词,那么其将具有潜在的临床应用价值。由于CTCs的出现成为肿瘤分期标准不可分割的一部分,针对其靶向治疗也许会成为癌症预后的关键。尽管CTCs在转移环境中的潜在性是显而易见的,但是对早期肿瘤中CTCs的评估将会更加获益,尤其是那些以早期进展为特征的肿瘤。基于膀胱癌特殊的临床表现,本文将阐述CTCs在早期膀胱癌的预后价值。

如果考虑临床表现,早期膀胱癌可以看做是一个整体但是有两个截然不同的方面^[8]。尽管大多数膀胱癌患者在诊断时仅局限于黏膜层或黏膜下层,但这些患者的预后对于早期疾病来讲是非常差的。到目前为止,对于惰性和侵袭性肿瘤在个体水平上的鉴定,受限于目前应用的欧洲癌症研究与治疗组织制定的风险评分的低敏感度^[9]。作为一个生物标志物,将CTCs应用于临床实践,就要明确其对肿瘤分期、预后、癌症的分子学特点以及治疗有潜在价值。Rink等^[10]在50例局限性膀胱癌中的15例检测到CTCs,和CTCs阴性患者相比,其总体生存率(P=0.001)、无进展生存率(P < 0.001)和癌特异性生存率(P < 0.001)均明显降低。Gradilone等^[11]报道CTCs的情况对于T1G3期膀胱癌患者的疾病无进展生存期具有独立的影响意义。CTCs提供了一种通过抽血就可以获得肿瘤物质的方法,被广泛地证明可以成为肿瘤诊断与判断患者预后的实时标志物,并且可检测药物的耐药性^[12]。

CTCs对于早期肿瘤的监测方面,CellSearch系统可以将CTCs通过磁流体的纳米粒子与靶向特异性细胞表面抗原(如EpCAM)的单克隆抗体相结合,与血液中的其他细胞区分开。但事实上,包括早期膀胱癌在内的各种类型肿瘤中仅约70%表达EpCAM抗原,一些肿瘤细胞由于发生了上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT),造成上皮细胞特异性抗原表达下调,从而使得单一抗体捕获CTCs的效率降低,为避免发生EMT的CTCs丢失,人们开始使用抗体"鸡尾酒分离CTCs,OncoCEE检测平台采用EpCAM、肿瘤相关钙信号转导蛋白2(tumor-associated calcium signal transducer-2,Trop-2)、原癌基因c-Met蛋白、叶酸结合蛋白受体、N-钙黏蛋白、间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)、EGFR抗体混合物孵育外周血细胞,与CellSearch体系相比CTCs的检测阳性率也显著提高。此外,CTC芯片是基于微流体学的检测技术,在芯片上装有78 000个由EpCAM抗体包被的显微位点,CTCs捕获率高达95%~99%,此法易行宜推广。当恶性肿瘤细胞有特异的靶向mRNA表达时,RT-PCR的应用提供了一项敏感的检测手段。例如:尿空斑蛋白是膀胱上皮特异的标志物,在蛋白水平低表达,但应用RT-PCR可检测其mRNA,识别出循环尿路上皮肿瘤细胞表面表达尿空斑蛋白,高度预示肿瘤复发。此外,考虑到在膀胱癌处理方面,人们更关注于早期肿瘤的监测,这就保证了在疾病开始进展之前明确诊断和治疗。

到目前为止,已制定的帮助早期膀胱癌患者判断预后的预测工具是由欧洲癌症研究和治疗组织制定的风险表,这些广泛应用的表格阳性预测价值非常低,换句话说,它能精确判定无进展的患者,但对实际进展的患者却不能明确判定。在这种评分系统中没有包括分子标志物可以判定位置较为表浅膀胱癌患者的预后。一些尿液标志物可以作为参考,但由于缺乏敏感度,没有一个可以在常规的尿液学检测中作为标准的诊断手段^[13]。因此,发现能够明确患者进展的新的标志物被提上日程。CTCs在局限期膀胱癌中的研究得出一些有争议的结论,主要由于研究样本量较小、患者分期的不同以及随访时间短^{[10, 14, 15]}。迄今为止,为明确临床上非转移膀胱癌患者CTCs意义的大宗前瞻性研究表明,即使是一个CTC的出现在肿瘤复发、癌症相关死亡率以及总生存方面都标志着较差的预后^[16]。自从2008年,人们就对CTCs的评估可以作为NMIBC患者的预后标志产生兴趣。近年来由于分子医学的迅猛发展,逐渐出现一些肿瘤细胞表面标志物,如膀胱癌细胞标志物Uroplakins、Mucin和细胞角蛋白。在NMIBC患者中检测到一些代表侵袭性行为的分子标志物,过表达的h-ras、fgf-r基因突变以及黏附分子的缺失等都对细胞间的相互作用以及细胞运动性的增加作出了解释,但到目前为止,这些基因检测都没有应用于膀胱癌的检测中^[17]。研究表明有存活蛋白表达的CTCs是早期膀胱癌无病生存期的独立预后因素^[11],存活蛋白是一种凋亡抑制剂,正常尿系上皮不表达,常过表达于膀胱癌并和预后差相关,因此关注这些细胞分子特征非常重要。最近报道通过CellSearch (Veridex LLC,Raritan,NJ,USA)对CTCs进行计数有助于对NMIBC患者进行预后分级。实际上,每7.5 ml至少出现1个CTC与短期内首次复发明显相关,CTCs阳性患者的疾病进展率为87%,对比CTCs阴性患者的疾病进展率为0^[18]。所有的这些初步报道都证实了在早期膀胱癌患者中CTCs对疾病进展有一定的预测价值。

最近在一大批均质性较好的高风险NMIBC患者中,有研究发现至少出现1个CTC是疾病进展的预测指标,根据国际指南,这就标志着T分级上升到T2或淋巴结阳性(N+)或存在远处转移(M1)^[19]。人们认为,这些肿瘤在疾病诊断期间是藏匿的,在这样的背景下,美国癌症联合协会将其分类为cM0(i+)并应用于乳腺癌分期,应该也适用于膀胱癌。那么应该如何对待cM0(i+)型肿瘤呢?对待这样的患者只是应用局部治疗方法是否正确或者行辅助化疗是否合理呢?几年前人们就想知道,早期膀胱癌患者发现CTCs就可能说明患者有疾病进展高风险性,这些患者可能要接受全身性治疗以清除播散的肿瘤细胞。膀胱癌患者在行膀胱癌根治性切除术后接受辅助化疗可以在总生存及无病生存上获益,表明cM0(i+)型早期膀胱癌患者接受辅助化疗的重要性^[20]。因此,根据微转移的概念,cM0(i+)型膀胱癌患者应该进行整体的综合治疗。

由于"早期"一词不适用于所有患者,因此有必要对早期膀胱癌患者实行个体化治疗。保留膀胱综合治疗降低相关发病率和死亡率的优势是非常明显的,但对于其中CTCs阳性者单独局部治疗并不充分。另外,欧洲和美国的指南认为,膀胱切除术有着治愈最佳可能性的优势,但同时大量患者被过度治疗。根治性手术的广泛应用以及早期膀胱癌的密切监测促使膀胱癌成为美国花销最多的癌症,大约每年37亿美元^[21]。CTCs研究是膀胱癌分子学的重大突破,并可以加速治疗个体化。但需要大规模的前瞻性试验来证实CTCs可以作为一种伤害性小、便宜以及可实时监测的工具,来对早期膀胱癌患者根据其进展的危险因素进行分层,以期指导临床。