细胞间隙连接(gap junction intercellular communication,GJIC)是由相邻细胞间通过间隙连接所介导的一种通讯方式,参与细胞间信息的传递,在调控细胞的增殖、分化中发挥着重要作用。其通道的主要成分是间隙连接蛋白(connexin-43,Cx43),目前,国内外对GJIC与癌变的关系进行了相关的研究,认为Cx表达缺陷和GJIC功能丧失,细胞间通讯失常,可使细胞间失去正常的接触,来自正常细胞的调控信号不能到达恶变细胞从而导致其无限制增殖,同时伴随物质能量代谢异常等,可能是导致肿瘤发生的因素^{[1, 2, 3, 4]},间隙连接和间隙连接蛋白已成为当今生命科学领域中的研究新热点。本研究通过检测不同分化程度的胃癌组织及正常组织的间隙连接超微结构及Cx43的改变为胃癌发病机制的研究提供新的思路,同时也为药物治疗提供潜在的作用靶点。

收集承德医学院附属医院2010年7月至2013年2月手术切除的胃癌组织60例,正常胃组织25例(距癌边缘10 cm以上正常胃组织),所有标本术前均未行化疗、放疗,60例胃癌患者中,男45例、女15例,年龄45~77岁,中位年龄(58.5±10.0)岁;高-中分化腺癌24例、低分化腺癌36例,无淋巴结转移者25例、有淋巴结转移者35例,TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者28例、Ⅲ+Ⅳ者32例、癌组织侵及浆膜者48例、未侵及浆膜者12例,采用透射电子显微镜、Western blot及RT-PCR方法进行检测。

电子显微镜样品制备所用试剂戊二醛、锇酸、Epon812、DDSA、醋酸铀、柠檬酸铅等购自美国Sigma Aldrich公司。Western blot所用试剂兔抗人一抗Cx43抗体购自美国Bioworld Technology公司,RIPA组织裂解液(BB120031)购自上海贝博公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒、羊抗兔HRP标记二抗及ECL超敏发光液均购自北京索莱宝科技有限公司,其余30%丙烯酰胺、β-巯基乙醇,10% SDS、10×丽春红、10%过硫酸铵、1.5M/1.0MTris-Hcl、TBST、1×电泳缓冲液及转膜液、显影粉、定影粉等由承德医学院基础研究所分子实验室提供。RTPCR试剂盒及DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司,PCR引物由北京赛百盛基因技术有限公司设计合成,Cx43:上游引物:5'-TCTCGCCTATG TCTCCTCCTGG-3',下游引物:5'-AGTTAGAGA TGGTGCTTCCCGC-3',扩增片段长度为156 bp;P85α:上游引物:5'-TGCTATGCCTGCTCTGTAG TGGT-3',下游引物:5'-GTGTGACATTGAGGGA GTCGTTG-3',扩增片段长度为175 bp;β-actin:上游引物:5'-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3',下游引物:5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3',扩增片段长度为453 bp。JEM-1200EX透射电子显微镜(日本JEOL公司产品),LELCA ULTRACUT UCT超薄切片机(奥地利ULTRACUT公司产品),紫外分光光度仪(DU800美国贝克曼公司),酶标仪MK3(Thermo LabSystems公司),DYY-6B型稳压稳流电泳仪(上海信然实业有限公司),PTC-220-PCR扩增仪(Research公司产品),2020D紫外荧光数字成像仪(GoldSpring产品)。

取组织切成1 mm³的小组织块固定于2.5%的戊二醛后,逐级脱水,Epon812包埋剂包埋,用于透射电子显微镜技术的超微结构观察。

取适量胃癌组织及远端正常组织标本(50~100 mg),剪碎,加入约600 µl RIPA蛋白裂解液和5 µl PMSF蛋白保护液,于匀浆器中,冰上匀浆充分碾碎,裂解30 min后将裂解液移至1.5 ml Ep管中,4℃ 12 000 r/min离心20 min,取上清液分装于Ep管中-20℃保存。取10 µl BSA标准品用PBS稀释至100 µl,使终浓度为0.5 mg/ml,将标准品按0、2、4、6、8、12、16、20 µl加到96孔板的蛋白标准品孔中,加PBS补足到20 µl,在酶标仪上测定,再绘制标准曲线计算蛋白浓度;SDSPAGE电泳:泳道边缘加上1×上样缓冲液,接好电极80 V电压跑浓缩胶,至分离胶时调整电压至120 V跑到带染料的蛋白质达到分离胶底部时即可停止,转膜,封闭,将杂交膜放入杂交袋中加入稀释好的一抗工作液37℃孵育过夜,用TBST洗膜3次分别为15、10、10 min,用2.5%封闭液按1:10 000稀释二抗,将X光片在显影液中浸泡约2 min,胶片从显影液-自来水-定影液中依次捞出,晾干进行胶片标记。胶片扫描后,采用相应软件对显影条带进行分析,计算条带与β-actin条带的灰度比值,作为蛋白的相对表达水平。

采用TRIzol试剂盒分别提取胃癌组织及正常胃组织的总RNA,Cx43的循环条件为94℃预变性5 min,94℃变性30 s,58℃复性30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸5 min,β-actin的循环条件为94℃预变性5 min,94℃变性30 s,55℃复性30 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸5 min。PCR扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳进行定性检测,相应位点出现单一电泳条带为阳性表达,以β-actin做内参照,电泳结果用凝胶图像分析系统进行吸光度测定。

实验数据通过SPSS17.0统计软件进行处理,灰度值用(x±s)表示,采用两独立样本t检验检测,以P<0.05为差异具有统计学意义。

正常胃组织细胞间连接从腺腔处依次可见紧密连接、桥粒连接和间隙连接;高-中分化胃癌组织细胞间隙连接结构破坏,低分化胃癌组织细胞间隙连接结构严重破坏,见图 1~3。

图 1 正常胃组织的间隙连接 (透射电子显微镜×100 000) Figure 1 Complete gap junctions in normal gastric tissues (TEM×100 000)

图选项

图 2 高-中分化腺癌中间隙连接破坏不完整 (透射电子显微镜×100 000) Figure 2 Incomplete gap junctions in well-moderately differentiated gastric cancer tissues (TEM×100 000)

图选项

图 3 低分化腺癌中间隙连接破坏不完整 (透射电子显微镜×300 000) Figure 3 Incomplete gap junctions in poorly differentiated gastric cancer tissues (TEM×300 000)

图选项

25例正常胃组织Cx43蛋白的相对含量与60例胃癌组织Cx43蛋白的相对含量比较差异有统计学意义(P=0.002),见表 1。高中分化者Cx43蛋白的相对含量为(0.54±0.04);低分化者Cx43蛋白的相对含量为(0.33±0.06);Cx43在TNM分期Ⅰ/Ⅱ蛋白的相对含量为(0.51±0.03),TNM分期Ⅲ/Ⅳ蛋白的相对含量为(0.32±0.09);侵及浆膜层组Cx43蛋白的相对含量为(0.36±0.09),未侵及浆膜层组Cx43蛋白的相对含量为(0.53±0.03);淋巴结转移组Cx43蛋白的相对含量为(0.35± 0.07),无淋巴结转移组Cx43蛋白的相对含量为(0.54±0.04)。经两独立样本t检验得出,差异有统计学意义(P均<0.05)。而Cx43蛋白在性别和年龄组中表达差异无统计学意义(P均>0.05),见表 2、图 4。

表 1 Cx43蛋白在正常和胃癌组织中的表达 (x±s) Table 1 The expression of Cx43 protein in normal and gastric cancer tissues (x±s)

表选项

表 2 Cx43蛋白及mRNA的表达与胃癌患者临床特征的关系 (x±s) Table 2 Relationship of Cx43 protein, mRNA expression and clinicopathologic features of gastric cancer patients(x±s)

表选项

图 4 Cx43蛋白在正常和胃癌组织中的表达 Figure 4 Expression levels of Cx43 protein in gastric cancer and normal gastric cancer tissues

图选项

25例正常胃组织Cx43 mRNA的相对含量与60例胃癌组织相对含量比较,差异有统计学意义(P=0.000),见表 3。高中分化者Cx43 mRNA的相对含量为(0.57±0.07);低分化者Cx43 mRNA的相对含量为(0.48±0.05);Cx43 mRNA在TNM分期Ⅰ/Ⅱ蛋白的相对含量为(0.56±0.06),TNM分期Ⅲ/ⅣCx43 mRNA的相对含量为(0.46 ±0.05);侵及浆膜层组Cx43 mRNA的相对含量为(0.45±0.06),未侵及浆膜层组的相对含量为(0.55±0.06);淋巴结转移组Cx43 mRNA的相对含量为(0.45±0.05),无淋巴结转移组的相对含量为(0.55±0.06);经两独立样本t检验得出,差异有统计学意义(P均<0.05)。而Cx43 mRNA在性别和年龄组中表达差异无统计学意义(P均>0.05),见表 2、图 5。

表 3 Cx43 mRNA在正常和胃癌组织中的表达 (x±s) Table 3 The expression of Cx43 mRNA in normal and gastric cancer tissues (x±s)

表选项

图 5 Cx43 mRNA在正常和胃癌组织中的表达 Figure 5 Expression levels of Cx43 mRNA in gastric cancer and normal gastric cancer tissues

图选项

细胞间直接信息传递是通过细胞间连接实现的,细胞间连接包括间隙连接、桥粒连接和紧密连接。紧密连接没有通讯功能,对桥粒连接的通讯功能研究较少,而近年间隙连接的生物学功能备受关注。间隙连接为一种接触面积较大的平板状连接,多见于上皮细胞深部侧表面,此处相邻的细胞膜之间隔以2 nm的间隙,在连接处相邻细胞膜中含有许多大小为6~8 nm呈六角形的颗粒,即连接子(connexon),每一连接子是由6个穿膜的膜内在蛋白质分子围成,中央有直径为2 nm的隧道。相邻细胞质膜上的连接子一一对应相接,隧道相同,构成了细胞间的直接通道,这种微细的管型通道相邻细胞各占一半,并可由6个亚单位以相互滑动的方式开启或关闭^[5]。我们通过电子显微镜对正常胃组织和胃癌组织进行超微结构观察发现:正常的胃黏膜间隙连接结构完整而胃癌的间隙连接结构遭到破坏,并且分化差的胃癌组织间隙连接结构遭到破坏较重,因此可以推断因细胞的间隙连接通讯功能缺失,细胞发生转化后其细胞间隙连接通讯功能降低或抑制,可能是促癌变阶段的重要机制,缝隙连接的缺乏可能参与了肿瘤的发生。

间隙连接是细胞通讯的结构基础,间隙连接功能多样性的基础是缝隙连接蛋白分子结构的多样性。Cx43是一种膜蛋白,是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础,Cx43作为间隙连接蛋白家族的重要成员,在维持正常细胞间信息交换、调节细胞增殖、分化等方面发挥重要作用^[6]。同时它也是构成胃癌组织GJIC中主要的连接蛋白^[7]。

Cx43表达减少或缺失与多种肿瘤的发生发展密切相关^{[8, 9, 10, 11, 12, 13]}。Cx43对肿瘤生长的抑制被认为是通过间隙连接散发一些生长抑制因子,如通过环腺苷酸参与GJ依赖的生长抑制,GJIC功能减低或缺失,来自正常细胞的调控信号则不能到达恶变细胞,使其无限制地生长导致肿瘤的发生^{[10, 11]}。正常细胞癌变过程中,缝隙连接蛋白表达降低,GJIC功能障碍,使细胞间失去接触抑制功能,肿瘤细胞异常生长,促进恶性演进,因此Cx43在肿瘤恶性演进过程中也发挥着重要作用。本研究结果亦证实Cx43在正常胃黏膜组织中的蛋白量较在癌组织中高,从而间接证实了细胞癌变过程中存在间隙连接通讯功能障碍。Tang等^[14]研究发现在胃肿瘤细胞中与邻近的正常细胞相比Cx43显著性的低表达,在有转移的淋巴结中与胃肿瘤细胞相比Cx43显著高表达,同时提出Cx43的低表达可能促成了胃癌的发生。本研究证实了Cx43在胃癌组织中的蛋白量比正常胃黏膜组织中低,Cx43在有淋巴结转移的胃癌中的表达比在无淋巴结转移者要低,高中分化胃癌Cx43的表达均高于低分化胃癌组,Ⅰ+Ⅱ期胃癌患者Cx43的表达高于Ⅲ+Ⅳ期者。所以我们推测Cx43可能与多种致瘤因素共同参与了胃癌的发生,并影响了胃癌的生物学行为。Cx43表达水平下降和间隙连接细胞间通讯功能异常可能参与了胃癌的恶性程度的进展和肿瘤细胞的侵袭转移。