肿瘤防治研究  2015, Vol. 42 Issue (7): 676-680
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管，湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

高剑坤，龙波，曾彬，唐旭. 2015.
GAO Jiankun, LONG Bo, ZENG Bin, TANG Xu. 2015.
出核因子CRM1抑制剂KPT-185对人前列腺癌细胞生长的影响
Effect of CRM1 Inhibitor KPT-185 on Growth of Human Prostate Cancer Cells
肿瘤防治研究, 2015, 42(07): 676-680
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42(07): 676-680
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2015.07.008

文章历史

收稿日期：2014-07-21
修回日期：2014-09-06
引用本文
高剑坤,龙波,曾彬,唐旭. 出核因子CRM1抑制剂KPT-185对人前列腺癌细胞生长的影响[J]. 肿瘤防治研究, 2015, 42(07): 676-680.
LI Zechao, ZHOU Yong, LUO Shiqiao. Effect of CRM1 Inhibitor KPT-185 on Growth of Human Prostate Cancer Cells. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42(07): 676-680.
出核因子CRM1抑制剂KPT-185对人前列腺癌细胞生长的影响
高剑坤1, 龙波2, 曾彬1,唐旭1    
1. 621000 绵阳，四川中医药高等专科学校 基础医学部；
2. 621000 绵阳，绵阳市404医院感染科
收稿日期：2014-07-21；修回日期：2014-09-06
作者简介: 高剑坤（1971-），女，博士，副研究员，主要从事肿瘤生物学研究
摘要：目的 探讨出核因子(chromosome maintenance region 1,CRM1)抑制剂KPT-185对人前列腺癌细胞生长、凋亡、迁徙的影响及影响产生的原因。方法 采用MTT、细胞集落形成能力测定法检测KPT-185对前列腺癌细胞生长的影响;划痕愈合实验检测KPT-185对前列腺癌细胞迁徙能力的影响;流式细胞仪检测KPT-185对细胞周期的影响;人组蛋白(Histone)/DNA酶联免疫法和膜联蛋白V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡;免疫印迹检测蛋白表达。结果 KPT-185能极大地抑制人前列腺癌细胞的生长,使其细胞周期阻滞于G0~G1期,并导致细胞凋亡。KPT-185引起的细胞生长抑制和凋亡是通过其抑制CRM1的核输出,使抑癌蛋白p53和p21保留于核内而发挥作用的。结论 KPT-185是一种新型的CRM1抑制剂,有望成为治疗前列腺癌的候选药物。
关键词： CRM1抑制剂     p53     p21     生长抑制     前列腺癌    
Effect of CRM1 Inhibitor KPT-185 on Growth of Human Prostate Cancer Cells
GAO Jiankun1, LONG Bo2, ZENG Bin1,TANG Xu1    
1. Department of Basic Medical Sciences, Sichuan College of Tranditional Chinese Medicine, Mianyang 621000, China;
2. Section of Infectious Diseases, Mianyang 404 Hospital, Mianyang 621000, China
Abstract：Objective To investigate the effect of chromosome maintenance region 1(CRM1) inhibitor KPT-185 on the growth,migration and apoptosis of prostate cancer cells and related reasons. Methods MTT assay,Clonogenic assay,Wound healing assay,flow cytometry analysis,Histone/DNA ELISA,Annexin V-FITC method and Western blot were used to detect KPT-185 effect on cell growth,migration,cell cycle,apoptosis,protein expression in prostate cancer cells and the potential mechanism,respectively. Results KPT-185 induction of cell apoptosis,growth inhibition and cell cycle arrest was involved in CRM1 inhibition and nuclear retention of tumor suppressor proteins p53 and p21 in prostate cancer cells. Conclusion KPT-185 as a new CRM1 inhibitor could be a potential drug in the treatment for prostate cancer.
Key words: CRM1 inhibitor     p53     p21     Growth inhibition     Prostate cancer    
0 引言

核内蛋白输出,对于保持核质中各种转录因子、信号分子以及细胞周期调控因子的恰当分布起着关键作用,是所有真核细胞的基本功能,核蛋白主要由出核因子(chromosome maintenance region1,CRM1)也被称为exportin1或Xpo1进行调节[1, 2, 3, 4, 5],经核孔复合体从核内转运到核外。CRM1是核转运受体中的输入因子β超家族的成员,能识别富含亮氨酸的核输出序列(nuclear export sequence,NES)的蛋白质[6]。CRM1/exportin1既是低等真核细胞又是高等真核细胞NES的受体,对于抑癌蛋白如p53、p21、FOXO等的核质运输起着重要作用[7]。多种抑癌蛋白需要在核内才具有抑癌活性或对化疗药物作出应答。阻断这些蛋白的核输出能抑制肿瘤细胞的生长或诱导凋亡,可作为一种肿瘤治疗策略[8]。因此,CRM1可作为治疗靶标用以设计抗癌药物。本文将介绍运用结构设计和高通量筛选而合成的新型CRM1抑制剂:KPT-185[9]的体外抗前列腺癌特性及其可能的分子机制。

1 材料与方法 1.1 材料

人前列腺癌细胞株PC-3和DU-145购于美国ATCC细胞库,培养在含10% FBS的RPMI 1640培养液中。p53和p21抗体购于美国Cell signaling公司。二抗购于美国Sigma公司。KPT-185由美国Karyopharm Therapeutic公司设计、合成并纯化。

1.2 方法 1.2.1 生长抑制检测

分别将1×106个PC-3和DU-145细胞种植于100 mm培养皿,培养过夜后加入不同浓度的KPT-185,48 h后对存活细胞计数。同时采用MTT法检测KPT-185对前列腺癌细胞的体外生长抑制。以5×103个/孔密度将PC-3和DU-145接种于96孔培养板,培养24 h后加入不同浓度KPT-185处理细胞,另设空白对照组,72 h后每孔加入10 μl,5 mg/ml溶于PBS的MTT (Sigma)试剂。37℃、5% CO2孵箱孵育2 h,每个浓度设3个复孔。使用TECAN酶标仪(TECAN,Switzerland)595 nm测量荧光值[9]。此外,还采用了细胞集落形成能力测定法检测KPT-185对前列腺癌细胞的生长影响。

1.2.2 细胞集落形成能力测定

分别将PC-3和DU-145细胞种植于6孔板,每孔种植3×105个细胞。培养过夜后加入不同浓度的KPT-185,72 h后将不同浓度KPT-185处理后的细胞种植入100 mm培养皿,每个培养皿种植3 000个细胞。细胞在37℃、5% CO2培养箱孵育21天后,用2%结晶紫染色并计量集落。

1.2.3 划痕愈合实验

划痕愈合实验用于检测细胞的迁徙能力。分别将PC-3和DU-145细胞种植于6孔板,每孔种植3×105个细胞。当细胞长至90%~95%融合时用枪头在6孔板底面划线。划痕用PBS清洗3遍以确保没有松散细胞粘连。细胞分别在含KPT-185或不含KPT-185的培养液中培养20 h后用显微相机(Nikon)拍照。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期

分别将1×106个PC-3和DU-145细胞种植于100 mm培养皿,培养过夜之后换无血清培养液培养24 h。培养液中加入KPT-185或DMSO后培养72 h后收集细胞,用70%(v/v)冰冷的乙醇固定24 h,以3000 g离心5 min,细胞经PBS清洗后重悬于含50 μg/ml的PI (propidium iodide,碘化丙啶)和100 μg/ml DNase-free RNase的PBS溶液中。样品在37℃放置15 min后用流式细胞仪(BD,San Jose,CA)测定DNA含量[9]。

1.2.5 人组蛋白(Histone)/DNA酶联免疫法检测细胞凋亡

用酶联免疫细胞凋亡检测试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)检测前列腺癌细胞的凋亡。分别将PC-3和DU-145细胞种植于6孔板,每孔种植3×105个细胞。培养24 h,用不同浓度KPT-185处理细胞72 h。采用人组蛋白(Histone)/DNA酶联免疫法检测细胞凋亡,溶解细胞后,提取胞质组蛋白/DNA片段,孵育于包被有抗组蛋白抗体的微量滴定板中,在使用ABTS显色前加入过氧化物酶结合的DNA抗体,最后用TECAN's酶标仪检测样品在405 nm的吸光值。

1.2.6 膜联蛋白V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡

使用膜联蛋白V-FITC (BioVision research,CA,USA)凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。PC-3和DU-145在KPT-185存在或缺失的培养液中培养72 h。离心收集1×105~5×105个细胞,用500 μl 1倍的结合缓冲液重悬细胞之后加入5 μl的膜联蛋白V-FITC和5 μl的PI。使用流式细胞仪检测样品。

1.2.7 蛋白质的提取和免疫印迹检测蛋白表达

使用NE-PER细胞核与细胞质提取试剂(Thermo Scientific,Rockford,IL)抽提细胞质和细胞核蛋白,使用BCATM蛋白检测试剂IL检测蛋白质浓度[9]。

1.3 统计学方法

采用GraphPad StatMate软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)进行数据分析。图中纵轴所示数据为绝对值或实验组与对照组数据的百分比,以(x±s)表示。实验组与对照组的比较采用t检验,P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 KPT-185对前列腺癌细胞存活力的影响

经KPT-185处理48和72 h后前列腺癌细胞的存活情况,见图 1A和1B。研究表明KPT-185对前列腺癌细胞PC-3和DU-145均具有浓度依赖的抑制作用。为进一步确认KPT-185对细胞生长的影响,进行了细胞集落形成能力测定实验,图 1C显示与对照相比,KPT-185阻碍了细胞集落形成。细胞集落形成能力测定的结果与细胞计数法和MTT法测定的结果一致,再次证明KPT-185对于人前列腺癌细胞PC-3和DU-145具有生长抑制作用。

A: cell viability of human prostate cancer cell lines PC-3(*: P=0.0026, **: P=0.0007, compared with control group) and DU-145(*: P=0.0012, **: P=0.0006, compared with control group); B: viable cell number determined using MTT assay; C: cell survival of human prostate cell lines PC-3 and DU-145 图 1 KPT-185对前列腺癌细胞生长的影响 Figure 1 Effect of KPT-185 on prostate cancer cell growth
图选项
2.2 KPT-185对细胞迁移能力的影响

本文采用划痕愈合实验检测了KPT-185对前列腺癌细胞PC-3及DU-145迁徙及浸润能力的影响,见图 2。KPT-185能抑制前列腺癌细胞PC-3和DU-145迁徙,抑制具有剂量依赖性,从而说明KPT-185能使前列腺癌细胞的迁徙能力下降。

图 2 KPT-185抑制细胞迁徙 Figure 2 KPT-185 inhibited cell migration
图选项
2.3 KPT-185导致前列腺癌细胞周期阻滞

采用流式细胞仪检测KPT-185对前列腺癌细胞周期的影响。将PC-3和DU-145细胞用KPT-185处理72 h后分析细胞周期阻滞情况,见图 3,阻滞于G0~G1期的细胞随着KPT-185浓度的增加而增多。KPT-185对细胞周期的影响进一步证实KPT-185是抗前列腺癌的有效候选药物。

X axis: DNA content; Y axis: nuclei number 图 3 KPT-185使细胞周期阻滞于G0~G1期 Figure 3 KPT-185 induced cell cycle arrest at G0-G1 phase
图选项
2.4 KPT-185导致前列腺癌细胞凋亡

本文假设前列腺癌细胞生长抑制的原因是产生了细胞凋亡。图 4A证实KPT-185能导致PC-3和DU-145细胞凋亡,并与剂量相关。膜联蛋白V-FITC/PI双染法结果也证明了KPT-185能导致PC-3和DU-145细胞凋亡,图 4B显示出经150 nmol/L浓度的KPT-185处理后膜联蛋白V-FITC/PI双染法检测到的凋亡细胞的相对数量。经KPT-185处理后PC-3和DU-145凋亡细胞的增加差异均具有统计学意义。

A: PC-3 and DU-145 cells were exposed to different concentrations of KPT-185 for 72 h. Apoptosis was determined by histone/DNA ELISA. PC-3 100 and 150nmol/L: **: P=0.0033 compared with control group, DU-145 150nmol/L: *: P=0.0322, compared with control group; B: PC-3 and DU-145 cells were treated with 150 nmol/L of KPT-185 for 72 h. Apoptosis of both cell lines was determined by Annexin V-FITC 图 4 KPT-185对前列腺癌细胞凋亡的影响 Figure 4 Induction effect of KPT-185 on apoptosis of PC cells
图选项
2.5 KPT-185上调p53和p21

为进一步了解KPT-185抗前列腺癌作用的分子机制,本文对相关的细胞信号转导通路进行了检测。由于p53和p21均为包括前列腺癌在内的重要抑癌分子,本文考察了KPT-185是否能通过抑制CRM1而上调p53和p21。提取经KPT-185处理后的PC-3和DU-145细胞的核蛋白,并进行免疫印迹分析,证实KPT-185具有抑制前列腺癌中p53和p21的核输出的活性,见图 5,与对照相比,随着KPT-185浓度增加,显著地上调核内的p53和p21,提示KPT-185阻碍了PC-3和DU-145两种前列腺癌细胞的细胞核p53和p21输出。

The protein levels of p53 and p21 were detected by Western blot in prostate cancer cell lines PC-3 and DU-145 treated with KPT-185 for 72h 图 5 KPT-185对p53和p21表达的影响 Figure 5 Effect of KPT-185 on the expression of p53 and p21
图选项
3 讨论

前列腺癌是男性最常罹患的恶性肿瘤之一,发现新的治疗前列腺癌的靶标迫在眉睫。本文目的在于研究KPT-185对前列腺癌细胞的体外抑制特性及其分子机制。选用两株人前列腺癌细胞PC-3和DU-145进行实验。通过MTT和细胞集落形成能力检测发现,KPT-185能极大地抑制细胞的生长。此外,KPT-185能导致细胞凋亡。实验结果同时证明KPT-185引起的细胞生长抑制和凋亡是通过其抑制CRM1的核输出,使前列腺癌抑癌蛋白p53和p21保留于核内而发挥作用的。本文展示了新型小分子CRM-1抑制剂KPT-185抑制前列腺癌的抑癌活性。

众所周知,抑癌基因p53在细胞周期、凋亡、DNA修复及衰老中扮演重要角色[10, 11, 12, 13]。此外,作为细胞周期依赖激酶抑制剂p21能调节诸如细胞周期阻滞、DNA复制与修复,细胞分化、衰老及凋亡等细胞进程[14, 15, 16, 17]。p21作用于G1检测点对阻滞细胞周期起着重要作用[18, 19]。p21也是包括p53在内的肿瘤抑制基因的主要下游靶标[20]。本研究发现,KPT-185能增加p53和p21的表达量,提示可能是因为p53和p21增加而抑制了肿瘤细胞的生长[21]。本文利用划痕愈合实验进一步检测了上调p53对PC-3和DU-145细胞迁徙的影响,发现,上调p53可阻碍肿瘤细胞的迁徙。由于p53与癌细胞迁徙密切相关[22],提示KPT-185可能是因为上调p53而抑制癌细胞迁徙。

总之,本研究结果表明,作为一种新型的CRM1抑制剂,KPT-185能通过抑制CRM1而减少p53和p21的核输出,是一种可用于治疗前列腺癌的新型抗癌候选药物。本文为治疗前列腺癌提供了新的策略。同时,由于KPT-185还可能对其他核内抑癌蛋白产生影响,因此需要进一步研究KPT-185与其他抑癌核蛋白的作用,以及这些蛋白与p53、p21之间的关系。

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