2015, Vol. 42文章信息
- 廖长春，周椿昊，肖兵，范阳华，祝新根. 2015.
- LIAO Changchun, ZHOU Chunhao, XIAO Bing, FAN Yanghua, ZHU Xingen. 2015.
- 血管内皮细胞通过Notch信号通路对胶质瘤细胞侵袭性生长的影响
- Effects of Vascular Endothelial Cells on Invasion of Glioma Cells via Notch Signal Pathway
- 肿瘤防治研究, 2015, 42(07): 652-656
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42(07): 652-656
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2015.07.003
-
文章历史
- 收稿日期：2014-08-07
- 修回日期：2015-03-12
引用本文 |
神经胶质瘤[1]是中枢神经系统最常见而又最难治愈的原发性恶性肿瘤,起源于神经胶质细胞,约占颅内肿瘤的50%,恶性程度高,侵袭性强[2];血管内皮细胞可通过分泌多种可溶性细胞因子上调胶质瘤细胞MMP-9、MMP-2、组织蛋白酶B等的表达[3, 4],从而促进胶质瘤细胞的侵袭性生长,与此同时,许多研究表明Notch信号通路[5]的激活与胶质瘤细胞的侵袭性关系密切[6]。本研究以人脑星形胶质母细胞瘤(U-87 MG)细胞株及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)为对象,研究Notch信号通路在内皮细胞促进胶质瘤细胞侵袭力过程中的作用,探讨在血管内皮细胞促进胶质瘤的侵袭过程中,Notch信号通路是否也起着重要的调控作用。
1 材料和方法 1.1 材料U87人脑胶质细胞瘤细胞株及人脐静脉内皮细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所。DMEM购自Hyclone公司;DAPT购自美国Sigma公司;Notch1、Notch2、Hes1、Dll4、Cathepsins B、MMP-9、MMP-2等PCR引物均购自美国Invitrogen公司;Trizol总RNA提取试剂、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司;兔抗人MMP-9多克隆抗体、兔抗人MMP-2多克隆抗体、辣根酶山羊抗兔IgG (二抗)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养条件U87细胞和HUVEC细胞均于含10% F BS的DMEM培养液中培养,在37℃、5% CO2、湿度95%的恒温培养箱孵育培养。
1.2.2 Transwell共培养取对数期生长的U87细胞以密度为1×105/cm2接种于Transwell六孔板下室,上室只含10 g/L F BS的DMEM培养液,即单纯组;取对数期生长的U87细胞以密度为1×105/cm2接种于Transwell六孔板下室,同样取对数期生长的HUVEC细胞以同样的密度(1×105/cm2)接种于Transwell系统上室,即共培养组;取对数期生长的U87细胞以密度为1×105/cm2接种于Transwell六孔板下室,同样取对数期生长的HUVEC细胞以同样的密度(1×105/cm2)接种于Transwell系统上室,培养液中加入DAPT,使其最终浓度为5 μmol/L,即DAPT处理组。以上各组均于37℃、5% CO2、湿度95%的恒温培养箱孵育。
1.2.3 Transwell体外侵袭实验取对数生长期的U87细胞,以10% FBS的DMEM培养液,调整细胞浓度为每毫升l×105个,取细胞200 μl接种于Transwell上室内,下室加入10% FBS的DMEM培养液500 ml,即单纯组;取对数生长期的U87细胞,以10% FBS的DMEM培养液,调整细胞浓度为每毫升l×105个,取细胞200 μl接种于Transwell上室内,取对数生长期的内皮细胞,调整细胞浓度为每毫升l× 105个/ml,取细胞200 μl接种于Transwell下室内,即共培养组;取对数生长期的U87细胞,以10% FBS的DMEM培养液,调整细胞浓度为每毫升l×105个,取细胞200 μl接种于Transwell上室内,取对数生长期的内皮细胞,调整细胞浓度为每毫升l×105个,取细胞200 μl接种于Transwell下室内,培养液中加入DAPT,使其最终浓度为5 μmol/L,即DAPT处理组;37℃、5% CO2培养24 h后,将滤膜上层细胞用棉签抹去,滤膜以甲醇固定,然后用结晶紫染色15 min。100倍光学显微镜下选择膜上下左右中5个不同视野的穿过膜细胞数,求平均值。
1.2.4 Real-time PCR检测Notch1、Notch2、Hes1、Dll4、Cathepsins B、MMP-9、MMP-2 mRNA的表达水平按照1.2.2中Transwell共培养系统培养细胞24 h后,取六孔板下室U87细胞用TRIzol总RNA提取试剂提取各组U87细胞总RNA,RNA按反转录试剂盒合成cDNA,反转录条件:37℃反应15 min,85℃反应5 s。以SYBR Green荧光染料掺入法进行扩增,扩增反应条件为95℃ 30 s;95℃ 5 s、60℃ 30 s,40次循环,结果判定采用2-ΔΔ法:ΔCT=CT目的基因-CT内参,ΔΔCT=ΔCT处理组-ΔCT对照组,处理组的相对表达值=2-ΔΔCT。对照组的相对表达值=l。实验结果以β-actin为内参照,计算各目的mRNA的相对表达水平,各基因引物序列:Notch1:正向引物:5'-AGCTACTCCTCGCCTGTGGACAA-3',反向引物:5'-ACATTAGAGTGCGGCGACGAGGA-3';Notch2:正向引物:5'-AAAAATGGGGCC AACCGAGAC-3';反向引物:5'-TTCATCCAGAAGGCGCACAA-3';Hes1:正向引物:5'-TAGCTCGCGGCAT T C CAAGC TG 3',反向引物:5'-AAGCGGGTCACCTCGTTCATGC 3';Dll4:正向引物:5'-ATCAACGAGCGCGGCGTACT 3',反向引物:5'-TTGGTGCCCAATACCCCCCT 3';Cathepsins B:正向引物:5'-CTGCAGCGCTGGGTGGATCTAGGAT-3',反向引物:5'-ACGTTGTAGAAGTTGTGCCCGGC-3';MMP-9:正向引物:5'-TGTGCTCTTCCCTGGAGACCTGA-3',反向引物:5'-ATGGCCTTCAGCGTGGCGCTAT-3';MPP-2:正向引物:5'-AGATCTTCTTCTTCAAGGACCGGTT 3',反向引物:5'-GGCTGGTCAGTGGCTTGGGGTA 3';内参β-actin:正向引物:5'-ACGGGGTCACCCACACTGTGC-3',反向引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-3'。
1.2.5 Western blot分析按照1.2.2中Transwell共培养系统培养细胞48 h后,取Transwell共培养系统六孔板下室U87细胞,用细胞裂解液分别提取各组U87细胞总蛋白,离心15 min,取上清液电泳,完毕后将样品转移至PVDF膜上,TBST洗膜后加入膜封闭液37℃封闭2 h,分别加入Cathepsins B、MMP-2、MMP-9一抗(1:1 000),4℃过夜。TBST漂洗后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1:5 000)室温孵育1 h,TBST洗膜后用化学发光法(ECL)曝光定影。所用内参为β-actin。
1.3 统计学方法所有数据均采用均数±标准差(x±s)表示,应用统计学软件SPSS19.0进行单因素方差分析,p < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组U87细胞生长情况倒置显微镜下观察各组细胞在培养24 h后的生长情况,结果可见共培养组U87细胞数目较多,增殖活力强,较聚集,细胞形态多样,多呈长梭形生长,胞质丰富,伪足长,细胞之间相互粘连完好呈网格状,且有向Transwell小室下聚集趋势,生长成中间密集,周围较稀疏。而DAPT处理组细胞数量较共培养组明显较少,但仍高于单纯组U87细胞。单纯组细胞生长形态为正常U87细胞,大多数细胞呈长梭形,数量中等,较稀疏。
2.2 各组U87细胞侵袭力的变化及比较镜下观察各组细胞可见共培养组细胞穿膜数量为(81.5±2.89)个,较单独培养组(40.0±3.92)个明显增多(F =217.84,P =0.00),细胞深染,聚集,交叉成网格状,阻断血管内皮细胞Notch信号通路后,穿膜数量为(61.8±4.72)个,较共培养组少,差异有统计学意义(F =38.01,P =0.004)。U87细胞与内皮细胞共培养后侵袭性明显增强,但在加入DAPT处理后侵袭性有所减弱,见图 1、2。
|
| 图 1 各组U87细胞Transwell体外侵袭实验(结晶紫染色×200) Figure 1 Invasion abilities of U87 cells in each group detected by Transwell in vitro (Cristal violet staining×200) |
|
| 图 2 各组U87细胞侵袭力的比较 Figure 2 Comparison of U87 cells invasion among each group |
Real-time PCR结果显示,当血管内皮细胞与胶质瘤共培养24 h后,U87细胞Cathepsins B、MMP-9、Notch-1、Notch-2、Hes-1、Dll4 mRNA的表达较单独培养组均明显上升,而DAPT处理组U87细胞Cathepsins B、MMP-9、Notch-1、Notch-2、Hes-1 mRNA的表达较单独培养组也有明显上调,但较共培养组增幅低(F CB=160.58,P =0.00;F MMP-9=127.55,P =0.00;F Notch-1=62.67,P =0.00;F Notch-2=143.47,P =0.00;F Hes-1=43.22,P =0.00)。然而,各组细胞MMP-2mRNA表达无明显变化趋势,差异无统计学意义(F MMP-2=5.49,P =0.06),见表 1~7、图 3。
|
| The expression of β-actin was also detected as controls.The expression of Cathepsins B,MMP-9,Notch-1,Notch-2,Hes-1,Dll4 were upregulated when co-cultured with HUVEC (P < 0.05),but they were a little bit down-regulated when treated with DAPT (P < 0.05) 图 3 共培养24h后U87细胞各基因mRNA的Real-time PCR统计结果 Figure 3 Relative expression of mRNA in U87 cells in each group detected by Real-time fluorescence quantitative-PCR after 24h |
当血管内皮细胞与胶质瘤共培养48 h后,U87细胞Cathepsins B (F =3180.93,P =0.00)、MMP-9(F =1170.56,P =0.00)蛋白表达较单独培养组均明显上升,而DAPT处理组U87细胞Cathepsins B (F =1765.41,P =0.00)、MMP-9(F =546.45,P =0.00)蛋白表达较单独培养组也有明显上调,但较正常培养组增幅低,MMP-2的表达在单纯组和共培养组(F =4.679,P =0.097)、共培养组和DAPT处理组之间(F =2.16,P =0.216)都无明显变化,见图 4、5。
|
| The expression of β-actin was also detected as controls.The expression of Cathepsins B,MMP-9 were up-regulated when co-cultured with HUVEC (P < 0.05),but they were a little bit down-regulated when treated with DAPT (P < 0.05).But the expression of MMP-2 were stable (P>0.05) 图 4 共培养4 8h后各组培养组U8 7细胞内MMP-2、MMP-9、Cathepsin B的蛋白表达变化 Figure 4 Expression of Cathepsins B,MMP-9,MMP-2 in U87 cells in each group detected by Western blot after 48h |
|
| The expression of Cathepsins B,MMP-9 were up-regulated when co-cultured with HUVEC (P < 0.05),but they were a little bit downregulated when added with DAPT (P < 0.05).But the expression of MMP-2 was stable (P>0.05).The expression of β-actin was also detected as controls 图 5 各组U87细胞内MMP-2、MMP-9、CathepsinsB、β-actin蛋白表达变化的统计结果 Figure 5 Relative expression of Cathepsins B,MMP-9,MMP-2 in U87 cells in each group detected by Western blot after 48h |
神经胶质瘤的侵袭性生长与肿瘤微环境密切相关,胶质瘤的微环境主要以胶质瘤细胞、血管内皮细胞[7]、间质细胞及免疫细胞为主,其中血管内皮细胞是微环境的重要调控者。韩易等[8]研究表明,肿瘤来源的内皮细胞与胶质瘤细胞系共培养后,可以明显增强肿瘤细胞的侵袭能力,并证明内皮细胞促进胶质瘤细胞侵袭性的机制与通过增加胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9等的表达有关,但是仍不明白内皮细胞是通过什么机制并如何通过促进胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9等的表达促进胶质瘤细胞侵袭性。
本实验再次证明人脐静脉内皮细胞可以促进U87胶质瘤细胞的生长,增加U87胶质瘤细胞的侵袭力,同时还发现Notch信号通路在人脐静脉内皮细胞促进U87胶质瘤细胞生长、侵袭等过程中承担着重要的作用,用DAPT抑制Notch通路后可以明显抑制U87胶质瘤细胞生长、侵袭,同时Notch1、Notch2、Hes1、Dll4、Cathepsins B、MMP-9的mRNA及Cathepsins B、MMP-9蛋白的表达水平下降,表明Notch信号通路与胶质瘤侵袭密切相关。内皮细胞可以通过分泌多种细胞因子上调胶质瘤细胞MMP-9、MMP-2、组织蛋白酶B等的表达,从而促进胶质瘤细胞的侵袭性生长,阻断Notch信号通路之后,胶质瘤细胞侵袭性也随之下降。
本实验仍存在一些疑点:第一,当我们使用DAPT抑制胶质瘤细胞Notch信号通路时,内皮细胞的Notch信号通路也受到影响,故无法确定DAPT对内皮细胞Notch信号通路的抑制作用对整个过程中的影响有多大,胶质瘤细胞侵袭性的下降也可能与内皮细胞Notch信号通路受到抑制有关,但是无论如何,我们都无法否认Notch信号通路在内皮细胞促进胶质瘤U87细胞侵袭性生长的过程中起重要的作用,但具体过程还有待进一步研究;第二,在Transwell体外侵袭实验中,我们检测到胶质瘤细胞与血管内皮细胞共培养后穿膜U87细胞增多,代表侵袭性增强的同时,各组胶质瘤细胞数目亦增加,所以不能排除是否因为DAPT和内皮细胞促进了胶质瘤细胞的增殖进而对穿膜细胞数也产生了影响。
本实验进一步研究了内皮细胞与胶质瘤的相互关系,证明Notch信号通路在内皮细胞促进胶质瘤侵袭性过程中的重要作用。故我们推测可以Notch信号通路作为药物靶点,促进对胶质瘤的临床治疗。既往研究表明,γ-分泌酶抑制剂能够抑制Notch信号通路蛋白水解酶,从而抑制NICD (notch intracellular domain)的释放[9],进而抑制Notch信号通路的激活;Notch配体Dll4在肿瘤血管中呈高表达,以Dll4为靶向的阻断剂可以抑制肿瘤血管新生[10];另外,Notch信号通路的抑制可以通过阻断配体的结合来达到,含有两个以上EGF R的重组片段可与Notch受体竞争性结合Notch配体[11],从而阻断信号转导。Notch信号通路作为胶质瘤基因靶向的新靶点符合肿瘤控制的主要原则和胶质瘤病理生理机制的重要特征,可以预测Notch信号通路作为新一类抗肿瘤治疗靶点有广阔的前景,本研究现阶段尚处在体外细胞水平阶段,此过程中Notch信号通路的具体作用机制尚不完全清晰,体内试验及特异性信号阻断手段将有助于进一步理解Notch信号通路在血管内皮细胞促进胶质瘤侵袭性生长过程中的作用机制,我们希望通过深入胶质瘤微生态学机制及胶质瘤生物学行为机制的研究和Notch信号通路的探索,能够促使针对Notch信号通路的抗肿瘤治疗策略尽早应用于临床,为胶质瘤的治疗提供更加安全有效的新方法。
| [1] | Maher EA, Furnari FB, Bachoo RM, et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter[J]. Genes Dev, 2001, 15(11): 1311-33. |
| [2] | Onishi M, Ichikawa T, Kurozumi K, et al. Angiogenesis and invasion in glioma[J]. Brain Tumor Pathol, 2011, 28(1): 13-24. |
| [3] | Kenig S, Alonso MB, Mueller MM, et al. Glioblastoma and endothelial cells cross-talk, mediated by SDF-1, enhances tumour invasion and endothelial proliferation by increasing expression of cathepsins B, S, and MMP-9[J]. Cancer Lett, 2010, 289(1): 53-61. |
| [4] | Das G, Shiras A, Shanmuganandam K, et al. Rictor regulates MMP‐9 activity and invasion through Raf-1-MEK-ERK signaling pathway in glioma cells[J]. Mol Carcinog, 2011, 50(6): 412-23. |
| [5] | Ehebauer M, Hayward P, Martinez-Arias A. Notch signaling pathway[J]. Sci STKE, 2006, 2006(364): cm7. |
| [6] | Alqudah MA, Agarwal S, Al-Keilani MS, et al. NOTCH3 is a prognostic factor that promotes glioma cell proliferation, migration and invasion via activation of CCND1 and EGFR[J]. PLoS One, 2013, 8(10): e77299. |
| [7] | El Hallani S, Colin C, El Houfi Y, et al. Tumor and endothelial cell hybrids participate in glioblastoma vasculature[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 827327. |
| [8] | Han Y, Su HX, Ma J, et al. Effects of vascular endothelial cell on invasion properties of glioma cells[J]. Lin Chuang Shen Jing Wai Ke Za Zhi, 2011, 8(3): 139-41.[韩易, 苏贺先, 马骏, 等. 肿瘤血 管内皮细胞对胶质瘤细胞侵袭力的影响[J]. 临床神经外科杂 志, 2011, 8(3): 139-41.] |
| [9] | Shih IeM, Wang TL. Notch signaling, gamma-secretase inhibitors, and cancer therapy[J]. Cancer Res, 2007, 67(5): 1879-82. |
| [10] | Ridgway J, Zhang G, Wu Y, et al. Inhibition of Dll4 signalling inhibits tumour growth by deregulating angiogenesis[J]. Nature, 2006, 444(7122): 1083-7. |
| [11] | Nagaraj R, Banerjee U. Regulation of Notch and Wingless signalling by phyllopod, a transcriptional target of the EGFR pathway[J]. EMBO J, 2009, 28(4): 337-46. |