胃癌的病因和发病机制尚未明确，但却是多个基因改变的积累。近年来，基因遗传易感性在胃癌发生发展过程中的作用逐渐受到重视，寻找与胃癌相关的遗传位点对胃癌的防治有重要意义^[1]。国外研究发现，硒蛋白基因多态性与多种恶性肿瘤发病密切相关。目前研究较多的硒蛋白有五类，分别是谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、硫氧还蛋白还原酶2（TrxR2）、硒蛋白（相对分子质量15000）（SEP15）、硒蛋白P（SelP)和硒蛋白S（SelS）。SelS作为一种跨膜蛋白，与内质网相关蛋白1共同组成内质网相关蛋白降解逆向转运通道，将错误折叠蛋白从内质网腔中逆向转运到细胞质中进行降解，进而抑制和调节内质网内错误折叠蛋白引发的炎性反应和免疫反应。Shibata等^[2]研究结果显示SelS基因启动子上G-105A多态性位点与胃癌的遗传易感性相关携带A等位基因的个体与GG基因型的个体相比，患胃癌的风险显著增加。但在中国人群中是否也有这种改变，目前还没有针对SelS基因启动子上G-105A及G-254A多态性位点与胃癌易感性的相关报道。本实验研究中国湖南地区汉族胃癌患者和健康人群SelS基因位点的多态性分布情况，探讨该位点多态性与胃癌的相关性。 1 资料与方法

1.1 研究对象

胃癌组：收集湖南省肿瘤医院2013年10月至2014年4月胃癌住院患者全血标本113例，其中男79例，女34例；年龄31~75岁，平均年龄（54.2±11）岁。健康对照组：收集同期中南大学湘雅三医院健康体检者111例，其中男64例，女47例；年龄34~85岁，平均年龄（51.0±12）岁。经询问病史、体检和实验室检查排除冠心病、高血压、糖尿病、肝肾功能不全等其他疾病。研究对象为无血缘关系的湖南籍汉族人群，在年龄、性别、饮酒和吸烟方面比较两组一般情况差异无统计学意义，具有可比性，见表 1，标本采集均经本人同意，并经医院伦理委员会审查和认可。

表 1 胃癌组和对照组基本资料 Table 1 General data of gastric cancer group and control group

表选项

基因组DNA提取试剂盒（美国OMEGA公司），蛋白酶K（20 mg/ml）（北京天为时代有限公司)，DNA MarkerⅠ（北京康为公司），2×Taq PCR Master Mix（北京康为公司），FastDigest®MscⅠ （美国Thermo公司），Thermo Hybaid PX2型PCR仪（美国Thermo公司） ，UV-1800分光光度计（日本岛津制作所），微型离心机（德国Eppendorf公司）。 1.3 基因组DNA的提取

取静脉血3 ml，EDTA抗凝，采用美国OMEGA公司提供的DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA，操作严格按照说明书进行，紫外分光光度计测定DNA纯度及浓度，波长设为260 nm和280 nm，-20℃保存备用。 1.4 引物设计和合成

在Pubmed-SNP数据库中分别查询SelS基因rs28665122（G-105A）、rs34713741（G-254A）两侧基因序列，应用软件Premier5.0设计引物，rs28665122上游引物：5′-TCTTGGCGTTCCATGACC-3′，下游引物：5′-AGCGTAGCCGGGATTTCTC-3′，产物长度为211 bp；rs34713741上游引物5′-CTTCCGGTGCGCTCCTAC-3′，下游引物：5′-GGCGACCACTGACTTCCTT-3′，产物长度为302 bp，通过Primer-BLAST验证引物的特异性并由南京诺唯赞生物科技有限公司合成引物。 1.5 PCR扩增

PCR反应体系为25 μl，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，DNA模板 2 μl（约100 ng），上下游引物（10 μmol/l）各1 μl，灭菌双蒸水8.5 μl；rs28665122 PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 2 min，共30个循环。rs34713741 PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，共35个循环。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在分子凝胶成像仪上检测PCR扩增产物特异性和扩增效率。 1.6 基因分型鉴定

rs28665122用FastDigest®MscⅠ（酶切位点为5′-TGG↓CCA -3′或3′-ACC↑GGT-5′）进行酶切反应，反应总体系为30 μl，包括PCR产物10 μl，FastDigest®MscⅠ 1 μl和10×限制性内切酶Buffer 2 μl，灭菌双蒸水17 μl；离心机瞬时离心5 s，以集中样品；于37℃水浴30 min后，酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶中电泳，分子凝胶成像仪下判读并拍照记录。rs34713741用FastDigest®HinfⅠ（酶切位点为5′-G↓ANTC-3′或3′-CTNA↑G-5′）进行酶切反应，反应总体系同rs28665122；于37℃水浴5 min后，酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶中电泳，分子凝胶成像仪下判读并拍照记录。分别随机选取50个PCR产物进行纯化后送上海铂尚生物技术有限公司测序。 1.7 统计学方法

用SPSS19.0进行统计学分析。样本群体SNP位点多样性进行Hardy-Weinberg平衡检验，以检验样本的代表性。胃癌组和对照组等位基因频率、基因型频率分布采用卡方检验及Fisher确切概率法分析，检验水准为α=0.05。 2 结果

2.1 SelS基因rs28665122和rs34713741位点PCR结果

见图 1A为SelS基因rs28665122 PCR产物，产物长度211 bp。见图 1B为SelS基因rs34713741 PCR产物，产物长度302 bp。

M: DNA marker I; A: 1~8: rs28665122 loci objective stripe; B: 1~9: rs34713741 loci objective stripe 图 1 SelS基因PCR产物电泳结果 Figure 1 Electrophoresis results of PCR products of SelS gene

图选项

rs28665122位点基因多态性分型：经限制性内切酶MscⅠ消化后只有1种酶切结果，见图 2A，即野生型纯合子GG型，电泳图仅可见1条211 bp条带。rs34713741位点基因多态性分型：经限制性内切酶HinfⅠ消化后可见3种酶切结果，分别为CC、TT、CT型，见图 2B。野生型纯合子CC含有HinfⅠ酶切位点，产生198 bp和104 bp两个片段，电泳图可见2条条带，突变型纯合子TT不含有HinfⅠ酶切位点，经HinfⅠ内切酶消化后仅有1条302 bp条带。杂合子CT型可被HinfⅠ酶切割为302 bp、198 bp、104 bp三个片段，电泳图可见3条条带。PCR产物经DNA测序验证，结果与酶切结果一致。

M: DNA marker; A: 1-7: GG genotype; B: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9: CC genotype, 3: CT genotype, 8: TT genotype 图 2 SelS rs28665122、rs34713741位点基因多态性酶切产物的电泳结果 Figure 2 Electrophoresis results of enzyme digestion products of SelS rs28665122 and rs34713741 gene polymorphisms

图选项

SelS rs28665122位点基因型及等位基因频率分布见表 2。结果表明，胃癌组、健康对照组基因型和等位基因频率分布无差异。SelS rs34713741位点基因型及等位基因频率分布见表 3，该研究人群基因型分布均符合Hardy—Weinberg平衡（PH-W>0.05），具有群体代表性。经χ2检验及非条件Logistic回归分析，胃癌组和健康对照组CC、CT、TT基因型比较差异有统计学意义（χ2=5.399,P<0.05,OR=1.89,95%CI: 1.10~3.23）；两组等位基因频率差异也有统计学意义（χ2=7.399,P<0.05）。

表 2 胃癌组与对照组SelS rs28665122位点基因型及等位基因频率分布 Table 2 SelS rs28665122 genotype and allele frequencies distribution in gastric cancer group and control group

表选项

表 3 胃癌组与对照组SelS rs34713741位点基因型及等位基因频率分布 Table 3 SelS rs34713741 genotype and allele frequencies distribution in gastric cancer group and control group

表选项

经过统计分析发现rs34713741位点CT和TT基因型在低分化癌组和淋巴结转移组明显增高，其与胃癌组的病理分化程度、淋巴结转移具有相关性（P<0.05），而与年龄、性别、浸润深度、Borrmann分型、肿瘤位置无相关性（P>0.05），见表 4。

表 4 SelS rs34713741位点基因型在胃癌组各临床因素中分布 Table 4 SelS rs34713741 genotype distribution in clinical factors of gastric cancer

表选项

SelS基因^{[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}位于15q26.3，包含有6个外显子和5个内含子，有两个分别由1 250和1 292个碱基组成的转录变体，均编码由189个氨基酸残基组成的蛋白，其中第188位为硒代半胱氨酸残基。SelS在生物体内分布广泛，在肝脏、心脏、肾脏、骨骼肌、脂肪组织、下丘脑和睾丸中都有其特征表达。SelS是一种内质网和细胞膜硒驻留蛋白，其生物学功能主要包括保护细胞免受氧化损伤、参与炎性反应和细胞凋亡、降解内质网相关蛋白。SelS基因发生突变，可能影响其蛋白功能的正常发挥，进而降低机体抵御肿瘤发生的能力。

胃癌是一种基因改变而引起的疾病，它的发生是一个多步骤、多因素进行性发展的过程。目前研究^[10]报道了SelS基因的15个多态位点（-539delT、G-105A、T12710C、G-254A、G1393A、G3217A、G3705A、G4283A、A4502G、C5227T、A5265G、A6218G、T9707C、C-1500A和C9000G），但研究最多的还是SelS基因的G-105A（rs28665122）和G-254A（rs34713741）两个多态性位点。Curran等^[11]在2005年对92个美国家系SelS基因除了C-1500A和C9000G的13个多态性位点进行了检测，结果显示，有3个多态性位点与炎症因子相关联，分别为G-105A、G3705A和C5227T；G-105A位点是功能性位点，能够影响炎性因子的表达。Santos等^[12]对481例桥本氏甲状腺炎患者和516例健康体检者的SelS rs28665122位点进行检测，发现携带A等位基因的个体与GG基因型的个体相比，其患桥本氏甲状腺炎的风险显著增加。Shibata等^[2]采用了聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）的方法，以日本268例胃癌患者和306非胃癌健康对照组为研究对象，检测位于SelS基因启动子上G-105A多态性位点与胃癌的遗传易感性，结果显示，携带A等位基因的个体与GG基因型的个体相比，其患胃癌的风险显著增加。Wang等^[13]研究了GPx3的单核苷酸多态性与胃癌的关联性，发现GPx3基因内含子rs3805435、rs3828599两个位点的多态性可以影响基因的表达从而降低胃癌的发生危险。王佳等^[10]对硒蛋白GPx1和TXNRD2两个基因多态性与胃癌遗传易感性的关系进行研究，发现单独GPX1和TXNRD2多态性与胃癌易感性无关，但是GPX1和TXNRD2基因多态性的相互作用可以降低胃癌的风险。

目前，国内还没有针对SelS基因多态性与胃癌的遗传易感性的相关报道。本研究采用PCR-RFLP技术对湖南汉族人群进行基因检测并经DNA测序验证酶切结果的准确性，证实该人群中可能不存在SelS rs28665122基因多态性位点，GG、GA、AA 3种基因型频率分别为1.0、0.0、0.0，G、A等位基因频率分别为1.0、0.0,与Shibata等^[2]研究结果不同，表明不同地区及不同人种之间SelS rs28665122基因型分布不同，存在明显的差异；人群中存在SelS rs34713741基因多态性位点，CC、CT、TT 3种基因型频率分别为0.580、0.330、0.089，C、T等位基因频率分别为0.746、0.254，临床资料分析发现rs34713741位点CT和TT基因型在低分化癌组和淋巴结转移组明显增高，其与胃癌组的病理分化程度、淋巴结转移具有相关性，而与年龄、性别、浸润深度、Borrmann分型、肿瘤位置无相关性，说明SelS rs34713741位点多态性可能影响肿瘤的分化程度及淋巴结转移。

同种基因、同一个位点，不同的地理环境，却得出不同的结果，说明基因多态性与环境危险因素之间存在交互作用，极大地增加了胃癌的患病风险，同时胃癌的发生发展涉及多个基因的改变，表现为多基因、多步骤的协同累积作用，因此需要深入研究基因间以及基因与环境间的交互作用。本研究尽管在实验中排除了可能的干扰因素，但样本量有限，其结果需要在不同人群和不同亚群中进行验证，才能得到更加可靠的结果。