结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其侵袭力非常强^[1]，在恶性肿瘤发病率中居第四，相关死亡率居第二位^[2]。由于结肠癌的发病位置较低，深入盆腔，且与肛管括约肌接近，考虑到保留肛门及其功能，故结肠癌手术不易彻底切除。在临床治疗上，无法进行结肠癌手术治疗或结肠癌术后会有化疗配合治疗。

奥沙利铂是继顺铂和卡铂之后的第三代新型铂类抗癌药，具有广泛的抗肿瘤谱，在人结肠癌模型中，都表现出广谱的体外细胞毒性及体内抗肿瘤活性作用。应用于治疗转移性结肠癌，辅助治疗原发肿瘤完全切除后的Ⅲ期结肠癌^[3]。而关于奥沙利铂抗肿瘤的作用机制，目前尚未完全清楚。本研究观察奥沙利铂对结肠癌大鼠的影响，为研究奥沙利铂治疗结肠癌的作用机制提供科学的基础数据。 1 材料与方法 1.1 实验动物

SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量（200±20）kg，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证SCXK（桂）2009-0002，实验动物使用许可证SCXK（桂）2009-0005。 1.2 仪器与试剂

奥沙利铂、二甲肼购自美国Sigma公司；VEGF试剂盒购自美国R&D公司；CD44V6试剂盒购自奥地利Bender Medsystems公司；兔抗羊IgG-HRP、兔抗人Caspase-3、兔抗人Caspase-7多克隆抗体、兔抗人survivin多克隆抗体购自Neomarkers生物技术公司；兔抗羊IgG-HRP、酶免分析仪购自美国Thermo Forma公司；垂直电泳仪、转膜及显影设备购自Bio-Rad公司；DDL-5 高速冷冻离心机购自上海安亭科学仪器厂；Gel doc 2000低温高速离心机购自德国西门子公司。 1.3 实验方法 1.3.1 结肠癌大鼠模型建立^[4]

42只SD大鼠均颈背部皮下注射二甲肼（30 mg/kg）。每周注射 1次，连续注射5周。随机抽取2只模型大鼠切取直肠用10%中性甲醛溶液固定24 h后，乙醇脱水，石蜡包埋，切割制备3 μm厚的组织薄片进行HE染色，病理学观察，检测结肠癌大鼠模型成型情况。 1.3.2 分组及给药

将成功建立结肠癌大鼠模型的40只SD大鼠随机分为4组，每组10只：模型组、奥沙利铂高剂量（27.2 mg/kg）、中剂量（13.6 mg/kg）、低剂量组（6.8 mg/kg）。结肠癌大鼠模型建立后，将奥沙利铂溶解于1 ml 5%的葡萄糖注射液，尾静脉注射给药，每3周给药一次，连续给药12周。另设正常组SD大鼠10只。正常组与模型组给予1 ml 5%的葡萄糖注射液代替。末次给药48 h后处死动物，取材。 1.4 指标检测

取相同地方相同长度的结肠组织，中性甲醛固定、脱水、包埋、切片，0.2%亚甲蓝染色。显微镜下观察记录结肠组织中异变腺窝病灶的数量。ELISA法检测结肠癌大鼠血清中CD44V6和VEGF的含量变化。Western blot法检测结肠癌组织中survivin、Caspase-3和Caspase-7的蛋白水平。 1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0软件。计量资料以(x±s)表示。组间比较采用t检验，经方差齐性检验，方差齐者采用t检验；方差不齐者采用矫正t检验进行统计处理。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 结肠癌大鼠组织病理学观察

与正常组相比，模型组结肠癌组织的肠腺和肠腺周带增大，癌细胞形状大小不一，腺样结构排列不规则，细胞核大小不等，核分裂现象多，见图 1。

A: Normal group; B: Model group 图 1 结肠癌大鼠的病理学观察结果(HE ×400) Figure 1Pathological observation of colon cancer rats (HE×400)

图选项

与正常组相比，模型组ACF的数量显著多于正常组ACF的数量（P=0.032）。与模型组相比，奥沙利铂高剂量组（P=0.041）、中剂量组（P=0.035）结肠组织中ACF的数量均有下降，见表 1。 2.3 奥沙利铂对结肠癌大鼠血清中CD44V6和 VEGF的影响

结果显示，与正常对照组比较，模型组血清中CD44V6和VEGF的含量显著增加（P=0.021，0.046）；与模型组相比，奥沙利铂高剂量组、中剂量组血清中 CD44V6和VEGF的含量下降。其中奥沙利铂高剂量的效果最好，差异有统计学意义（P=0.043，0.038），见表 1。

表 1 奥沙利铂对结肠癌大鼠结肠组织中ACF及血清中CD44V6和 VEGF的影响 (x±s, n=10) Table 1 Effect of oxaliplatin on ACF in colon tissue and VEGF, CD44V6 in serum of colon cancer rats (x±s, n=10)

表选项

Western blot结果显示，与空白组相比，模型组、奥沙利铂给药组结肠癌组织中的survivin和Caspase-3、Caspase-7蛋白水平均上升。与模型组相比，奥沙利铂给药组结肠癌组织中的survivin蛋白水平降低；Caspase-3和Caspase-7蛋白水平升高，见表 2、图 2。

表 2 奥沙利铂对结肠癌组织中survivin，Caspase-3和Caspase-7表达的影响 (x±s, n=10) Table 2 奥沙利铂对结肠癌组织中survivin，Caspase-3和Caspase-7表达的影响 (x±s, n=10)

表选项

图 2奥沙利铂对结肠癌组织中survivin、Caspase-3和Caspase-7表达的影响 Figure 2 Effect of oxaliplatin on survivin, Caspase-3 and Caspase-7 expression in colon cancer tissues

图选项

结肠癌是消化道中最常见的恶性肿瘤,以40~60岁年龄段为高患病率年龄段^{[5, 6]}。在欧美国家，结肠癌是位居恶性肿瘤发病率的第三位和因恶性肿瘤导致相关死亡的第二位^[7]。由于结肠癌早期缺乏特异症状，故发现患病时已为肿瘤中晚期，且大多已有转移。手术切除是目前临床上主要的治疗手段，由于结肠癌的发病位置较低，深入盆腔，且与肛管括约肌接近，考虑到保留肛门及其功能，故结肠癌手术不易彻底切除，所以在进行手术治疗的同时还需要服用化疗药物配合治疗。

目前治疗结肠癌的主要有5-氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨等化疗药物，以及贝伐单抗、西妥昔单抗等靶向药物^[8]。奥沙利铂是第三代新型铂类抗癌药，在人结肠癌模型中，都表现出广谱的体外细胞毒性及体内抗肿瘤活性作用。相对于卡铂、顺铂、伊立替康等抗肿瘤药物，奥沙利铂无明显的耳、肝、肾毒性，可用于肾脏损害的肿瘤患者，不良反应相对较少的药物^[9]。

异变腺窝病灶是结直肠癌发生过程中可在光学显微镜下观察到的最小最早期的大肠黏膜病变^[10]。近年有文献提出ACF数量的改变是结肠癌病变指标的推测开始^[11]，ACF已经成为许多实验室筛选抗结直肠癌药物的重要指标^{[4, 12, 13]}。实验结果显示，经奥沙利铂治疗后的结肠中ACF的数量较模型组明显减少，提示奥沙利铂对结肠癌大鼠有一定的治疗效果。

CD44V6是黏附分子家族中的一员，是CD44中含有变异型外显子v6编码序列的分子。近年来研究表明，CD44V6基因是肿瘤转移促进基因，能与透明质酸等多种配体分子结合，介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的黏附，通过黏附、迁移、渗透、信号转导等促进肿瘤细胞的侵袭转移^[14]。CD44V6是判断肿瘤生物学行为及预后因素的重要指标^[15]。血管内皮生长因子（VEGF）对内皮细胞的分裂和迁移具有激活作用，是引起序贯生成的中药的血管生成因子。实验结果显示，与正常组相比结肠癌大鼠血清中CD44V6和VEGF的含量明显提高。表明结肠癌大鼠中肿瘤血管的生成增加和有浸润转移。奥沙利铂治疗组血清中CD44V6和VEGF的水平较模型组低。说明奥沙利铂可通过调节VEGF的水平，减少肿瘤内血管的生成和浸润转移，从而使判断肿瘤生物学行为的指标CD44V6的含量也下降。

survivn基因是一种哺乳动物细胞凋亡的抑制基因，是现今发现最强的凋亡抑制因子^[16]。survivn基因是通过抑制凋亡核心的蛋白酶家族Caspase中 Caspase-3亚族中Caspase-3和Caspase-7抑制细胞凋亡。奥沙利铂治疗组survivn基因的表达降低，Caspase-3和Caspase-7的表达增高。表明奥沙利铂在治疗结肠癌的过程中，通过抑制survivn基因的表达，从而使被survivn基因调控的与细胞凋亡密切相关的蛋白Caspase-3和Caspase-7表达上升。使Caspase-3和Caspase-7在细胞内微管的聚会、解聚得以顺利进行，促进细胞周期G2及M期的细胞凋亡。