在女性生殖器官恶性肿瘤中，卵巢癌（ovarian cancer）发病率占第三位，然而病死率一直位居第一位。原因是大多数卵巢癌发病隐匿，约75%的患者发现时已属晚期。针对晚期卵巢癌，癌细胞减灭术加紫杉醇/铂类联合化疗，能暂时缓解疾病进展，但是肿瘤复发率却高达80%以上^[1]。因此，迫切需要寻找新的治疗卵巢癌的有效方法。随着分子生物学的飞速发展，分子靶向治疗已成为当今卵巢癌防治研究的热点。溶酶体组织蛋白酶L（Cathepsin L）是一种溶酶体半胱氨酸水解蛋白酶，可降解基底膜和细胞外基质，其在肿瘤细胞的侵袭及转移过程中起着重要作用^[2]。此外，上皮细胞-间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在肿瘤转移中也发挥了关键作用^[3]。然而，关于Cathepsin L是否能够调节卵巢癌细胞的迁移及侵袭能力，则尚未有研究报道。本研究拟应用RNA干扰技术将靶向Cathepsin L基因的shRNA稳定转染卵巢癌离体细胞株SKOV3，观察Cathepsin L基因表达沉默后对SKOV3迁移及侵袭的影响以及EMT相关指标的表达变化，初步探讨Cathepsin L基因在卵巢癌细胞中的作用机制。 1 材料和方法

1.1 细胞培养

人卵巢癌细胞ES-2、SKOV3、OV1以及OV2购自于中科院上海细胞库。四株细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，并置于体积分数为5%CO2、37℃的细胞培养箱内培养。 1.2 Cathepsin L特异性shRNA和转染

shRNA购自美国Santa Cruz公司（Cat. No:sc-29939-SH）。采用脂质体转染技术，具体操作流程参照英韦创津公司的Lipofectamine2000产品说明书。48 h后加入筛选抗生素G418，浓度为400 μg/ml，维持培养6天后，G418浓度改为200 μg/ml；细胞扩增后，提取蛋白和RNA，进行RT-PCR和Western blot鉴定。将构建好的稳定细胞株命名为SKOV3/shRNA，空白组和对照组分别为SKOV3和SKOV3/Con。 1.3 荧光定量PCR

采用TGuide RNA提取试剂盒（Tiangen公司）提取RNA。反转录反应则采用TAKARA的PrimeScript™ Ⅱ Reverse Transcriptase 试剂盒。荧光定量PCR引物则由Premier Primer 5.0 软件来设计，序列如下：人Cathepsin L前导链：5’-CTGGTGGTTGGCTACGGATT-3’，人 Cathepsin L后随链：5’-CTCCGGTCTTTGGCCATCTT-3’（261 bp）；人GAPDH前导链： 5’-AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，人GAPDH后随链：5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT -3’（232 bp）。实验重复3次。 1.4 蛋白印迹法（Western blot）

将约1×107个细胞加至蛋白裂解液，冰上静置30 min，低温离心20 min（转速12 000 r/min），提取上清液。应用BCA定量法计算蛋白的浓度。取60 μg总蛋白跑胶（恒压100 V）。电转膜30 min。含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h。一抗4℃冰箱过夜。二抗孵育1 h后显影。Cathepsin L、E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、total-AKT、Snail以及GAPDH抗体均购自美国Santa Cruz公司。 1.5 Transwell小室法检测细胞侵袭能力

首先将Transwell小室放进24孔板里，然后将稳定转染Cathepsin L或阴性对照序列的细胞用胰蛋白酶消化，用不含胎牛血清的RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，随之将细胞重悬，每孔加入100 μl细胞悬液，在小室的下层加入500 μl 1%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在培养箱中放置24 h。最后取出小室，弃掉培养液，使用棉签轻轻擦去小室内的残余细胞。甲醛固定并结晶紫染色。显微镜下观察，随机选取8个视野进行细胞计数。 1.6 细胞划痕实验

将生长状态良好的各组细胞以2×105个/ml接种于6孔板内，每孔2 ml。待细胞长至约80%汇合时，用200 μl枪头垂直划出一无细胞的细痕，分别观察0、12、24 h时细胞划痕处细胞运动变化，随机选取3个视野并计算划痕区域的细胞数，3次独立实验。 1.7 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差x±s表示。Transwell侵袭实验采用析因设计方差分析比较各组间差异；荧光定量PCR实验采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较各组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 卵巢癌细胞中Cathepsin L的表达

荧光定量PCR结果显示，见图 1。四株卵巢癌细胞中，SKOV3的Cathepsin L表达水平最高（以此为参照），而ES-2、OV1以及OV2细胞的表达水平分别为0.72±0.04、0.34±0.03和0.55±0.05。因此，选择SKOV3作为研究对象进行下一步实验。

图 1 Cathepsin L在四株人卵巢癌细胞中的表达水平 Figure 1 Expression of Cathepsin L in four human ovarian carcinoma cell lines

图选项

图 2所示，特异性shRNA经过转染筛选后，Western blot显示Cathepsin L的蛋白水平较前明显下降，荧光定量PCR结果显示，SKOV3、SKOV3/Con以及SKOV3/shRNA细胞的相对表达水平分别为 0.99±0.05、0.96±0.07以及0.37±0.03，Cathepsin L的核酸水平表达均较对照组显著下调（P＝0.00527），结果提示，Cathepsin L表达下调的SKOV3细胞株构建成功，并用于下一步实验。

**: P<0.01，compared with control group 图 2 shRNA显著抑制SKOV3细胞的Cathepsin L表达 Figure 2  shRNA significantly suppressed Cathepsin L expression in SKOV3 cells

图选项

划痕0 h时两组细胞贴壁良好，划痕完全，划痕处无细胞贴壁或悬浮；划痕12 h后，SKOV3/Con组较SKOV3/shRNA组的迁移细胞明显增多；划痕24 h后，SKOV3/Con组的划痕基本愈合，而SKOV3/shRNA组的划痕尚未愈合，见图 3。

图 3 Cathepsin L基因敲除对SKOV3细胞迁移的影响 Figure 3 Effect of Cathepsin L gene transfection on the migration of human ovarian cancer cells SKOV3

图选项

SKOV3、SKOV3/Con组和SKOV3/shRNA组的穿膜细胞数分别为93.67±8.62，90.33±12.22和35.67±4.73。与对照组相比，SKOV3/shRNA组细胞侵袭能力受到显著抑制（P＝0.00372），见图 4。

图 4 Cathepsin L对细胞体外侵袭能力的影响 Figure 4 Effect of Cathepsin L knockdown on the invasion of SKOV3 cells

图选项

通过 Western blot 检测发现，SKOV3/shRNA组的E-cadherin表达显著增加，而N-cadherin的表达显著降低；此外，Cathepsin L干扰组细胞的Snail、p-AKT表达较对照组显著下降，见图 5。结果提示Cathepsin L可能通过调节Snail和p-AKT两种上游信号因子来调控EMT的发生。

图 5 Cathepsin L基因敲除对SKOV3细胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail以及p-AKT表达的影响 Figure 5 Effect of Cathepsin L gene knockdown on the E-cadherin, N-cadherin, Snail and p-AKT expression in human ovarian cancer cells SKOV3

图选项

卵巢癌是一类恶性程度较高的肿瘤，容易发生局部浸润及远处转移^[1]。Cathepsin L是溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族中的一员，可通过分解代谢多种蛋白质参与机体的多种生理病理活动，目前研究已证实，其在肺癌、乳腺癌、结肠癌以及黑色素瘤等多种肿瘤中高表达，并与预后密切相关^{[4, 5, 6, 7]}。本研究结果表明，在卵巢癌中，Cathepsin L是高表达的；成功构建Cathepsin L低表达的细胞株后，发现该组细胞的迁移及侵袭能力较对照组显著下降（P<0.01)。因此推测Cathepsin L基因是卵巢癌的促转移相关基因。

EMT作为上皮源性肿瘤发生发展过程中的重要步骤，与肿瘤浸润及转移密切相关，其主要特征为上皮标志物E-cadherin表达的减少，间质标志物N-cadherin表达的增加^[8]。Snail是E-cadherin的主要调节因子，可通过与Smad相互作用蛋白（SIP1）竞争性结合E-cadherin蛋白启动子区的E-box连接基序，抑制E-cadherin的表达，从而诱导EMT发生^[9]。有研究表明，Cathepsin L能直接作用于E-cadherin，使其降解，从而松动细胞间的粘连，增强肿瘤细胞的侵袭能力^[10]。因此，我们推测Cathepsin L是否通过调节Snail来调控E-cadherin的表达水平，从而推动EMT的发生。

我们进一步研究结果显示，卵巢癌细胞在Cathepsin L下调后，Snail分子的表达水平较对照组显著降低，而E-cadherin表达显著增加，N-cadherin表达则显著下降，提示了Cathepsin L与卵巢癌细胞EMT密切相关，其部分机制可能为Cathepsin L通过对Snail因子的调控，从而影响E-cadherin的表达水平。然而，值得注意的是，EMT的调节涉及多条信号通路，且这些信号通路之间可能还存在着相互作用。PI3K/AKT通路是目前研究得比较深入的与EMT密切相关的信号通路^[11]。为了进一步明确Cathepsin L对EMT的调节作用，我们还检测了PI3K/AKT通路的关键调节因子p-AKT的表达，发现Cathepsin L下调后，p-AKT蛋白表达亦受到明显抑制，这提示了Cathepsin L对EMT的调控可能也与PI3K/AKT通路相关。

综上所述，本研究探讨了Cathepsin L与EMT及卵巢癌细胞迁移侵袭之间的相互关系，发现Cathepsin L可通过调控EMT的发生影响卵巢癌细胞的迁移及侵袭，其可能机制为调节EMT上游通路分子Snail及p-AKT。这为进一步揭示Cathepsin L基因与卵巢癌的关系提供新的实验依据，为探讨卵巢癌转移的分子机制提供新的思路。