肺癌居我国肿瘤死亡病因首位，五年生存率小于15%。其中，约85%肺癌患者为非小细胞肺癌（NSCLC）患者^[1]。目前常规治疗方法如手术切除、化疗的治疗效果均不理想，综合治疗效果差^[2]。肺癌发病过程中涉及多种癌基因及抑癌基因变化^[3]。白血病抑制因子（leukemia inhibitor factor,LIF）是一种多功能细胞因子，对胚胎干细胞、造血细胞等多种细胞的增殖、分化都有重要作用^[4]。近年研究发现LIF参与多种肿瘤的发病过程^[5]。目前已有文章报道人肺癌细胞可以分泌LIF^[6]，但LIF在非小细胞肺癌中的作用尚不明确。本实验利用重组LIF干预非小细胞肺癌细胞系A549和Z793，探讨肺癌组织中LIF高表达对肺癌细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制。 1 材料和方法

1.1 实验材料

TRIzol（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒FSQ-101（日本Toyobo公司）；荧光定量PCR试剂盒（美国Bio-Rad公司）；非小细胞肺癌细胞系A549（中科院上海细胞库）；DMEM高糖培养液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；重组LIF因子（美国Chemicon公司）；蛋白裂解液（美国Thermo公司）；白血病抑制因子（LIF）、AKT、mTOR和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Santa Cruz公司）；MTT试剂（美国Sigma公司）；Transwell板（美国Corning公司）。 1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR

在人NSCLC组织中加入1 ml TRIzol裂解细胞，提取总RNA。用反转录试剂盒将总RNA转录成cDNA。反应条件：37℃15 min；98℃ 5 min。FQ-PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex TaqTMIⅡ Mix 10 μl,上游引物（10 μmol/L） 0.5 μl，下游引物（10 μmol/L） 0.5 μl，模板cDNA1 μl，ddH2O 8 μl，总体积为20 μl。反应条件：95℃ 30 s； 95℃ 5 s； 60℃15 s； 72℃ 20 s；扩增40个循环。扩增结束后，采用ΔΔCT法对结果进行分析。引物序列见表 1。

表 1 目的基因PCR引物序列 Table 1 PCR primers of target genes

表选项

取40 μg总蛋白于10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用半干式电印迹将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入相应一抗，4℃过夜，洗膜后分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加增强化学发光试剂（ECL），将膜放入X线片暗盒、压片、显影、定影，以GAPDH的表达作为参照，目的条带的灰度值与内参条带的灰度值比较。 1.2.3 细胞侵袭实验

在Transwell上室膜上涂1 mg/ml的Matrigel 50 μl，37℃孵育30 min，取1×105/ml细胞接种于Transwell上室内，并分为4组：A549对照组、A549 LIF处理组（LIF 100 ng/ml）、Z793对照组、Z793 LIF处理组（LIF 100 ng/ml），每组3个复孔；重组LIF因子处理肿瘤细胞48 h；下室加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液600 μl，置37℃、5% CO2培养箱中48 h后取出，将滤膜以4%多聚甲醛固定，棉签擦掉膜表面细胞，用Giemsa染料染色10 min；200倍光学显微镜下计数10个不同视野中穿过膜的细胞数。 1.2.4 MTT检测细胞增殖

取5×103个细胞接种于96孔板，将细胞分为4组：A549对照组、A549 LIF处理组（LIF 100 ng/ml）、Z793对照组、Z793 LIF处理组（LIF 100 ng/ml），每组3个复孔；重组LIF因子处理肿瘤细胞48 h；每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h；弃上清液，加入DMSO 150 μl，室温下摇床震荡10 min，酶标仪上测定570 nm处的吸光度值。 1.3 统计学方法

采用SPSS12.0统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差x±s表示，两组间均数比较采用t检验；多组均数间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 荧光定量PCR和Western blot检测LIF在人NSCLC组织和癌旁组织中的表达

荧光定量PCR结果显示人NSCLC组织中LIF的含量较正常癌旁组织明显增高（P=0.0078），Western blot结果亦显示NSCLC组织的LIF表达量增高，条带灰度增强，提示LIF可能参与结肠癌的病理过程，见图 1。

A: quantification of LIF mRNA expression in NSCLC tissues and non-tumor tissues(**: P=0.0078); B: the expression of LIF in non-small-cell lung cancer tissues and adjacent tissues detected by Western blot. LIF: leukemia inhibitory factor; GAPDH: control group; Case1-2, Case5-6: pathological tissues of different cases; N: adjacent tissues; T: NSCLC tissues 图 1 人NSCLC组织和癌旁组织中LIF的表达 Figure 1 The expression of LIF in non-small cell lung cancer tissues and adjacent tissues

图选项

重组LIF处理A549及Z793细胞24 h后，通过检测穿过人工基底膜Matrigel的细胞数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。LIF处理组分别与对照组相比，细胞侵袭穿过Matrigel膜的细胞数目增多，见表 2。

表 2 Transwell实验检测重组LIF因子对细胞侵袭的影响 Table 2 Effect of LIF on cell invasion detected by Transwell assay

表选项

重组LIF处理各组细胞48 h后，测定570 nm处的吸光度值表示肿瘤细胞的增殖情况。结果显示A549 LIF、Z793 LIF处理组较A549、Z793对照组肿瘤细胞的增殖明显增加，见表 3。

表 3 MTT实验检测重组LIF因子处理对细胞增殖的影响 Table 3 Effect of LIF on cell proliferation evaluated by MTT assay

表选项

重组LIF处理细胞后，肿瘤细胞中AKT蛋白表达量较对照组无明显差异，但AKT蛋白的磷酸化增加，条带灰度增强，其下游mTOR蛋白的表达量亦明显增加，见图 2。

Notes: **: One-way analysis of variance; a: P=0.0086, treatment group (A549) vs. control group(A549); b: P=0.0125, treatment group(Z793) vs. control group(Z793) 图 2 Western blot实验检测重组LIF因子对肿瘤细胞AKT/mTOR信号通路活化的影响 Figure 2 The effect of LIF on AKT/mTOR signaling pathway activation evaluated by Western blot

图选项

白血病抑制因子（LIF）是白细胞介素-6（IL-6）家族中的一员，因其能够促进白血病细胞的分化并抑制白血病细胞的增殖而得名，其可以参与细胞的增殖、凋亡^[7]、黏附^[8]、迁移^[9]等多种生物学过程。LIF通过与靶细胞膜上的二聚体受体结合发挥生物学效应。该二聚体受体由LIFRα和gp130两个跨膜蛋白构成。本研究证实LIF在非小细胞肺癌中持续高表达，并且高度活化，可能参与了非小细胞肺癌的发生发展，所以本研究致力于探讨LIF因子的过度表达和肿瘤细胞增殖、侵袭之间的关系。

目前研究表明，AKT/mTOR信号通路的过度激活可见于多种恶性肿瘤，它可以调节细胞周期等调节细胞的增殖。已有文献报道，在非小细胞肺癌中存在AKT/mTOR信号通路的活化，且与肿瘤的进展具有相关性^[10]。最新文献表明，在乳腺癌中，LIF可以通过激活AKT/mTOR信号通路促进肿瘤发生。抑制AKT后可以阻断LIF导致mTOR信号通路的激活及LIF促肿瘤的发生作用^[11]。本研究发现非小细胞肺癌中LIF促进肿瘤增殖和迁移作用是通过激活AKT/mTOR信号通路实现的。但其具体的调控机制尚不明确。因此，进一步明确LIF和AKT/mTOR信号通路的相互作用成为今后工作的重点。

综上所述，非小细胞肺癌中存在LIF的过表达，并且高表达的LIF可以通过激活AKT/mTOR信号通路促进肺癌细胞增殖和侵袭，进而促进非小细胞肺癌的发生发展，这些结果将为非小细胞肺癌的治疗提供潜在分子药靶。