细胞周期进程受到相关的细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）的连续性调控。p27^kip1（p27）是CDKs抑制因子的重要成员之一。G₀期p27^kip1蛋白开始翻译生成，并与cyclinE-CDK2结合发挥抑制作用，此时p27^kip1蛋白的稳定性最大。G₁早期，p27^kip1促进D型cyclin-CDKs组装和入核。p27^kip1在G1期的不断减少使得cyclineE-CDK2和cyclinA-CDK2激活G1期向S期的转化。正常细胞中，p27^kip1蛋白水平主要受控于泛素依赖的蛋白水解。p27^kip1活性主要受不同水平的表达与特异的翻译后修饰调控。p27^kip1不表达或表达水平下调与人类恶性肿瘤的侵袭性相关，包括胃、前列腺、结肠、肺的恶性肿瘤^[1]。 p27^kip1的细胞核内表达能促进其发挥CDK抑制剂的作用，而p27^kip1在细胞质的过量表达则与肿瘤的高侵袭性和不良预后密切相关^{[2, 3, 4, 5, 6]}。p27^kip1表达水平下调和移位的分子学机制仍不明确，但现有研究显示磷酸化与p27^kip1的细胞质移位有密切的关联^{[7, 8, 9, 10]}。本文就p27^kip1的亚细胞定位在肿瘤研究中的作用、磷酸化对p27^kip1亚细胞定位的影响及p27^kip1的研究对肿瘤治疗及预后方面的影响进行综述。 1 p27^kip1的亚细胞定位在肿瘤研究中的作用 1.1 p27^kip1的双向性与p27^kip1亚细胞定位

p27^kip1在肿瘤发生发展中的作用似一把双刃剑，一方面p27^kip1基因是典型的抑癌基因。在成神经管细胞瘤研究中，转基因后缺失一个或两p27^kip1等位基因的小鼠生存率低于拥有一对p27^kip1等位基因的小鼠^[11]。但p27^kip1基因杂合小鼠的生存率却低于p27^kip1缺失的小鼠。这个有趣的结果揭示了一种可能，p27^kip1单个等位基因的保留能调节cyclin D/Cdk4/6复合物的装配从而促进细胞周期进程，但是不足以抑制cyclin E/Cdk2。这个推测也与之前学者提出的p27^kip1基因单倍不足和剂量依赖的性质相吻合^[12]。许多研究表明p27^kip1有肿瘤抑制作用，但是p27^kip1基因的丢失究竟是引起肿瘤的起始还是进程加速呢？最新研究表明p27^kip1基因单倍不足和丢失都是作用在加速肿瘤进程而非促使肿瘤早期形成^[13]。 另一方面，p27^kip1又发挥了原癌基因的作用，这种作用通过其亚细胞定位的不同而体现。Denicourt等^[2]的实验显示，在侵袭性及转移性黑素瘤中，70%表现出p27^kip1在细胞质出现，而非侵袭性及原位黑素瘤中，未出现p27^kip1的细胞质定位。非细胞周期蛋白激酶结合型p27^kip1在细胞质表达诱导黑素瘤的能动性，并导致淋巴结、肺、腹膜的多处转移。考虑到p27^kip1细胞质定位的机制可能是p27^kip1出核使细胞核内p27^kip1与CDK结合减弱，但实验表示，即使很低水平的p27^kip1细胞质定位，对黑素瘤的能动性及转移性潜能有很明显的促进作用。Serres等^[14]建立p27-/-和p27CK-（一种不能结合并抑制细胞周期依赖性蛋白激酶的突变体）小鼠肿瘤发生模型，p27CK-小鼠与p27-/-小鼠相比表现出肿瘤体积增大和侵袭性增强，且发现在肺组织中，肿瘤发生率的增加与p27CK-的亚细胞定位相关。因此推测p27CK-蛋白定位在细胞质时发挥原癌基因的作用。基于p27^kip1的亚细胞定位推测p27^kip1至少有两种功能：细胞核内p27^kip1结合CDK发挥的功能和细胞质内独立于CDK抑制作用的功能。p27^kip1的细胞核内表达能促进其发挥CDK抑制剂的作用，p27S10A突变小鼠使p27^kip1绝大多数分布于细胞核，即使降低总p27蛋白水平，也能对氨基甲酸乙酯诱导的成瘤实验起到抵御功效^[15]。实验证实p27的细胞核表达对鼻咽癌的发展及预后是一个有利的表现^[16]。而p27^kip1在细胞质的过量表达则与肿瘤的高侵袭性和不良预后密切相关，如胃癌^[3]、卵巢癌^[4]和透明细胞型肾细胞癌^[5]。在慢性白血病的研究中，急性期CD34⁺细胞的p27胞质表达明显高于慢性期的CD34⁺细胞^[17]。Kariagina等^[6]研究显示与乳腺原位癌相比，侵袭性乳腺癌中，增殖性增强和细胞核内p27^kip1低表达更为明显。她还发现孕酮有调控细胞内p27^kip1蛋白定位和增殖的功能，并第一次在活体实验和体外实验中证实了孕酮/孕激素对p27^kip1细胞定位的低表达调控可促进细胞增殖。由此看来，p27^kip1的细胞质移位可能成为一个能提示肿瘤恶性程度和不良的预后的新指标。 1.2 p27^kip1亚细胞定位的多种调控

研究显示有多种因子和信号通路参与调控p27^kip1的细胞质定位。Ras信号通路对p27^kip1细胞定位有双重调控作用。激活的RalA结合蛋白1（RalA binding protein 1，RalBP1）通过Ras信号通路诱导p27^kip1在细胞质的堆积，这一诱导过程以PKB（protein kinase B，蛋白激酶B）/Akt 介导的S10位点磷酸化为基础。这个通路对抗与S10位点无关的磷脂酶D1（phospholipase D alpha 1，PLD1）诱导的细胞核内p27^kip1定位。PLD1受抑制时则诱导p27^kip1的细胞质内定位。激活的RalA能通过RalBP1介导的p27^kip1细胞质内堆积来废除转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的生长抑制作用^[18]。 研究发现TGF-β超家族成员Nodal对滋养层细胞有抗增殖、抗移位和抗侵袭作用^[19]，能通过增强其稳定性提升p27^kip1mRNA和蛋白水平。在p27^kip1S10位点磷酸化的基础上同时诱导p27^kip1和CDK2从核内输出^[20]。p27^kip1和CDK2的细胞质移位反过来也参与调节Nodal在滋养层细胞中的抗增殖、抗移位、抗侵袭作用。同样，甲状腺激素受体作用蛋白6（thyroid hormone receptor interactor 6，TRIP6）通过调控AKT的活化促进AKT介导的p27^kip1识别与磷酸化，特别是能促进p27^kip1的细胞质定位^[21]。从以上研究可以看出，一些信号通路对p27^kip1细胞定位的调控是以p27^kip1位点磷酸化为基础的，如S10位点磷酸化^{[18, 19]}。幽门螺杆菌诱导磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-Kinase，AKT/PI3K）介导的p27^kip1T157和T198位点磷酸化，导致胃癌中p27^kip1的细胞质移位，预示着胃癌的不良预后^[3]。 2 p27^kip1磷酸化与亚细胞定位

S10作为最重要的p27^kip1磷酸化位点，可以被多种激酶磷酸化，促进p27^kip1的细胞质定位，发挥其增加p27^kip1稳定性的作用。Mohanty等^[22]研究显示，G0和G1期，初形成的p27^kip1迅速被KIS（kinase-interacting stathmin）或MIRK（minibrain-related kinase）诱导S10位点的磷酸化，从而使稳定性提高。PIM激酶和Rho相关的卷曲蛋白激酶（ROCK）诱导的C-末端自身磷酸化是以S10位点磷酸化为基础的。体外实验证实S10位点非磷酸化突变的p27^kip1蛋白在C-末端不能被磷酸化。S10位点的磷酸化与p27^kip1的亚细胞定位密切相关。在C6肿瘤细胞中JNKs促p27^kip1S10位点磷酸化，使生长停滞期p27^kip1在胞质内稳定性增高^[7]。人工培育非磷酸化突变体p27^kip1S10Ala表达的巨噬细胞中，观察到p27^kip1蛋白表达水平降低，细胞核内p27^kip1增加，p27^kip1 S10位点磷酸化缺陷并不影响细胞增殖^[8]。既往的研究提出，Akt可以在体外磷酸化S10位点^[23]，即使Akt/PKB通路受阻也不能降低p27^kip1 S10位点磷酸化的水平^[24]，这更进一步说明了S10位点的磷酸化受多种激酶的调控。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）诱导跨膜四超家族成员5（transmembrane 4 L six family member 5，TM4SF5）介导的S10位点磷酸化与Akt活性无关，JNK能将S10位点磷酸化^{[7, 25]}。实验证实pS10p27与肿瘤患者的不良预后相关^[26]。此外，p27^kip1的S10位点磷酸化对p27^kip1抑制CDK2的功能起到重要的调控作用，S10位点磷酸化的p27^kip1不能起到CDK2抑制的作用^[22]。

除了S10位点以外，T157、T198、Y88等p27^kip1的磷酸化位点的磷酸化皆与p27^kip1的亚细胞定位密切相关。T157，T198和酪氨酸位点的磷酸化对p27^kip1的细胞质定位有稳定作用，并促进cyclinD1-CDK复合体的结合和活性，以减弱p27^kip1对cyclin E-CDK2的抑制作用，即减弱p27^kip1的抑癌作用^[27]。T157是p27^kip1核定位序列（nuclear localization signal，NLS）上的AKT磷酸化位点，T157位点磷酸化促进p27^kip1细胞质定位。肾细胞癌细胞系中，激活的PI3K/AKT信号通路与p27^kip1的亚细胞定位相关。p27^kip1的NLS被T157磷酸化，同时表现为p27^kip1的细胞质定位，此表现又与肿瘤分级的升高有关。PI3K抑制剂（抑制AKT活性）可抑制T157磷酸化并诱导p27^kip1的细胞核移位^[9]。p27T157位点磷酸化的表现对肝细胞肝癌起到不良的预示^[10]体外实验中证实，蛋白激酶C（protein kinase C，PKCs）包括PKCα和PKCδ能使p27^kip1的T198位点磷酸化。丙二醇甲醚醋酸酯（pacific maritime association，PMA）依赖的PKC活化能提高p27^kip1的磷酸化和稳定性，从而起到对人乳腺癌细胞系-7（michigan cancer foundation - 7，MCF-7）和 HeLa 细胞的细胞周期抑制作用^[28]。JAK2可在Y88位点磷酸化p27^kip1。在拥有突变JAK2V617F等位基因的患者来源细胞系中，致瘤原性的JAK2V617F能降低p27^kip1的稳定性和蛋白表达水平。当小发夹RNA诱导JAK2V617F失活，p27^kip1的酪氨酸磷酸化被修复，p27^kip1表达亦回升^[29]。 3 p27^kip1相关的肿瘤治疗

p27^kip1作为细胞周期负性调控因子，它的缺失或低表达能够诱导细胞有丝分裂，从而达到促进细胞增殖的作用。p27^kip1的有效调控可以诱导新生耳蜗器官的增殖^[30]，活体或体外降低p27^kip1的表达可以诱导螺旋器增殖。新的研究证实了p27^kip1调控螺旋器增殖的功能，并通过调控p27^kip1来诱导细胞分化，预计起到功能恢复的治疗作用^[31] 。除了促进细胞增殖，p27^kip1蛋白同样还起到调节细胞分化的作用，在小鼠体内诱导性多功能干细胞来源的少突胶质前体细胞中，p27^kip1蛋白的超表达增强了少突胶质细胞的分化效率，是体外对照实验的八倍以上。除了用调控p27^kip1表达的方法治疗肿瘤，p27^kip1亦可作为指导药物选择的指标。研究表示排除了磷酸化及细胞亚定位的影响，p27^kip1的基础表达水平可以作为指导患者选择雷帕霉素治疗的指标，但是此研究仍缺乏临床依据^[32]。 有学者提出p27^kip1突变体应用于肿瘤治疗的可行性。Lu等^[33]的研究表示可以通过p27^kip1磷酸化抑制PI3K/AKT通路从而起到肝癌治疗的效果。Wang等^[34]提出JAB1、p27^kip1S10和总p27^kip1表达水平三者结合分析，可作为肝细胞肝癌预后指标。Kim等^[35]提出p27^kip1的表达下降是眼睑皮脂腺癌不良的预后指标。类似的，p27^kip1表达水平亦可为头颈部鳞状细胞癌化疗提供预后的参考^[36]。近期有学者设计出一种新的复合物，能够模拟p27^kip1的作用与cyclinA-CDK2结合。此种新型CDK抑制剂作用于细胞能导致细胞周期停滞和细胞凋亡。作为特异的cyclinE/cyclin A-CDK2抑制剂，通过阻止细胞周期进程，抑制肿瘤细胞增长，为今后肿瘤治疗的研究提供了新的方法和思路^[37]。

综上所述，p27^kip1以及与其作用相关的信号通路和因子在细胞增殖和细胞分化中扮演着极其重要的角色，但具体的分子机制仍有待进一步研究。p27^kip1亚细胞定位与肿瘤治疗和预后相关的研究缺乏临床依据。p27^kip1亚细胞定位与肿瘤的高度侵袭性和不良预后密切相关，p27^kip1的亚细胞定位又受到p27^kip1不同位点磷酸化作用的调控，p27^kip1磷酸化各位点的发现及其发挥的作用，仍是研究的重点。