近来研究表明，灵芝多糖（ganoderma lucidum polysaccharide,GLP）可通过提高机体免疫能力抵抗肿瘤生长^[1]。但是对肿瘤免疫逃逸作用的研究较少，有文献报告，将灵芝多糖用于黑色素瘤细胞上清液（B16F10-CS）培养的淋巴细胞，可完全或部分拮抗B16F10-CS所致的IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)升高，认为灵芝多糖对肿瘤免疫抑制有拮抗作用^[2]。本实验观察灵芝多糖用药后，小鼠脾脏及血液中相关免疫因子、淋巴细胞的含量变化等，并探讨其可能的免疫逃逸机制，为传统中药治疗肿瘤疾病提供依据。

人膀胱癌T24细胞株购自中科院上海细胞库。4~6周龄雌性Balb/c裸鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司（许可证号：SCXK京2009-0004）。RPMI 1640、胎牛血清、胰蛋白酶由美国Hyclone公司提供。二甲亚砜（DMSO）由美国Sigma公司提供。灵芝多糖购自杭州众芝康菇生物技术有限公司，使用时用0.5%羧甲基纤维素钠溶液溶解，以RPMI 1640培养液稀释至工作浓度。顺铂由山东齐鲁制药厂提供，用0.9%氯化钠溶液溶解。CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司。VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。小鼠 IL-10、IL-2、TGF-β、ELISA试剂盒由上海逸峰生物科技有限公司产品。PerCP-Cy5.5/CD8a-FITC、CD3 PerCP-Cy5.5/CD4-PE、CD49b-APC、Gr-1和CD11b、CD11C-PE 抗体购置于上海鑫乐生物科技有限公司（美国Biolegend 原装）；异硫氰酸荧光素 ( FITC）单抗 ( 美国 Genzyme 公司产品）。Trizol 总RNA提取试剂盒、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂均购自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶购自Takara公司。GTVision^TM Ⅲ抗鼠兔通用型免疫组织化学检测试剂盒由基因科技上海有限公司提供。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

取对数生长期人膀胱癌T24细胞，锥虫蓝染色实验示活细胞数>95%。2.0×10⁶个细胞重悬于200 μl PBS，皮下接种于裸鼠右侧腋窝。待小鼠肿瘤长至纵径4~5 mm时，随机分为3组：0.9%氯化钠溶液组、顺铂组、顺铂+灵芝多糖组，每组5只。分别以0.9%氯化钠溶液、0.9%氯化钠溶液、灵芝多糖（200 mg/kg）灌胃18天，以0.9%氯化钠溶液、顺铂（25 mg/kg）、顺铂（25 mg/kg）腹腔注射5天。第19天处死小鼠，分别收集外周血、剥离瘤块及脾脏。

遵循动物福利学原理，将小鼠脱颈断头处死，无菌条件下小心解剖并取出脾脏，脾脏指数=脾脏重量（mg）/体重（g）×10。计算好脾脏指数后，置消毒平皿中剪碎，以PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）冲洗1次，以玻璃注射器内芯轻磨，200目滤网过滤，用吸管收集滤液至离心管，800 r/min离心10 min，弃上清液，加入Tris-NH₄Cl（0.15 mol/L NH₄Cl，pH 7.4）裂解红细胞，800 r/min离心10 min，弃上清液，再用PBS、RPMI1640各洗1次（800 r/min离心10 min），弃上清液，加RPMI 1640完全培养液（10%犊牛血清、青霉素100 u/ml、链霉素100 mg/ml）。为除去吞噬细胞，将脾细胞置皮氏培养皿中于37℃孵育1 h，收集非贴壁的脾淋巴细胞。调整细胞浓度至1.5×10⁶/ml，锥虫蓝染色测定细胞生存率大于95%。

于实验第19天在SPF级实验室操作台摘小鼠眼球取外周血，收集于经肝素预处理的试管中。室温条件下按 1:10 的体积比加入37℃的红细胞裂解液，反复轻柔吹打与外周血混匀，2~4 min后，加PBS液10 ml终止反应，离心（1 500 r/min，6 min），用PBS液洗涤、离心2次。用Hank’s液混匀离心沉淀物。在离心管中加入淋巴细胞分离液，分离液和外周血沉淀液体积比为2:1，按该比例向离心管中加入外周血沉淀液。将该离心管离心（2 000 r/min，20 min），离心后淋巴细胞将集中在离心管中部（第二层云雾状的低密度细胞），红细胞沉于离心管底部，小心除去上清液，吸出淋巴细胞层悬液置于装有PBS液的试管中，PBS液洗涤、离心2次（1 500 r/min，8 min），重新悬浮细胞。离心后，管内液体分四层,中间云雾状细胞层即为淋巴细胞层。

CD8+T细胞利用CD3 PerCP-Cy5.5/CD8a-FITC 双抗体进行标记，CD4+T细胞利用CD3 PerCP-Cy5.5/CD4-PE双抗体进行标记，NK细胞利用CD49b-APC进行标记，MDSC细胞用Gr-1和CD11b抗体标记，DC细胞利用CD11C-PE抗体标记。加入抗体后室温静置30 min，30 min后用PBS洗涤2次，用400 μl 1%多聚甲醛固定，利用流式细胞仪检测小鼠脾脏和血液中各免疫细胞所占比例。

24 孔板内每孔加入500 μl各组待测外周血，调整细胞浓度为2×10⁶/ml，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液补充至每孔1 000 μl，每个终浓度设3个复孔，并设空白对照孔（只含RPMI 1640培养液）。在37℃、5%CO2条件下培养2天后，分别吸取上清液，按照ELISA试剂盒说明操作检测IL-10、VEGF、TGF-β、IL-2和TNF-α含量。

mRNA的提取按上述方法制备脾细胞悬液后，采用Trizol试剂盒按说明书操作提取RNA。所提RNA用DEPC处理水50 µl溶解，用5 µl检测RNA的完整性，其余-20℃保存备用。取上述mRNA溶液 10 µl，按照反转录试剂盒操作进行cDNA扩增，反应产物即cDNA第1链-20℃保存备用。IL-2的上下游引物分别为：5'-ACTCACCAGGATGCTCACAT-3'和5'-AGACTTGTCTACCTAATGGA-3'，合成片段长度为256 bp；TNF-α的上下游引物分别为：5'-TCTCGAACCCCGAGTGACAA-3'和5'-ACCGCACCTCGACTCTCTAT-3'，合成片段长度为123 bp；β-actin的上下游引物分别为：5'-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3'和5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3'，合成片段长度为320 bp。引物由上海生物工程公司合成。以上述cDNA第1链为模板进行PCR扩增，PCR反应体系总体积为50 µl。PCR循环条件为：94℃ 5 min，1个循环；94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 0.5 min，进行30个循环反应；最后72℃延伸5 min。取PCR扩增产物20 µl经5%琼脂糖凝胶电泳，1%溴化乙锭显色后用MultiImageTM Light Cabinet Filter Positions凝胶扫描仪对电泳凝胶中的PCR产物条带进行密度扫描，以β-actin（肌动蛋白）作为RT-PCR的质控，计算 IL-2、TNF-α mRNA与其对应的β-actin峰面积的比值，从而得出LBPP作用荷瘤鼠后IL-2、TNF-α mRNA 表达的相对变化。

取小鼠脾脏组织进行研磨、匀浆、超声处理后，加入细胞裂解液于冰上裂解，离心取上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测样品蛋白浓度。将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，用SDS-PAGE电泳分离后，加入兔抗人IL-2和TNF-α 单克隆抗体（1:1 000），4℃孵育过夜，洗膜5 min×3次，再加入HRP标记的羊抗兔IgG（1:3 000）室温孵育1 h，洗膜5 min×3次后进行化学发光检测。

采用SPSS 15.0软件进行统计分析，所有实验数据以（x±s）表示采用t检验，所有流式标本均用Cell Quest软件计算所得，P < 0.05为差异有统计学意义。

给予灵芝多糖灌胃后荷瘤鼠体重逐渐增加，第19天解剖小鼠后发现顺铂组脾脏重量明显减轻，顺铂+灵芝多糖组脾重较顺铂组明显增高，脾脏指数为（90.20±6.43）mg/g显著大于顺铂组脾脏指数（51.85±2.56）mg/g，差异有统计学意义（P < 0.001），见表 1。

表 1 灵芝多糖对荷瘤小鼠脾脏指数的影响 (x±s,n=5) Table 1 Effect of GLP on spleen index of tumor-bearing mice (x±s,n=5)

表选项

利用流式细胞仪检测脾脏各淋巴细胞亚群的含量。顺铂组用药后小鼠脾脏内的CD8⁺T、CD4⁺T、CD49b⁺NK、CD11b⁺MDSC和CD11c⁺DC细胞均较0.9%氯化钠溶液小鼠脾脏内相关免疫细胞明显减少，尤其以CD4⁺T和CD11c⁺DC细胞所占含量减少显著。给予灵芝多糖灌胃用药后，小鼠脾内CD8⁺T、CD4⁺T、CD49b⁺NK和CD11c⁺DC细胞含量均有不同程度的增高，CD8⁺T和CD4⁺T细胞含量分别增加3.16%，2.97% 。而CD11b⁺MDSC细胞含量较顺铂组降低1.47%，见图 1。结果表明灵芝多糖可提高化疗后脾脏相关免疫细胞的含量，减少髓源性抑制细胞的含量。

1: normal saline group; 2: cisplatin group; 3: cisplatin +GLP group 图 1 流式细胞术分析灵芝多糖对小鼠脾脏中免疫细胞亚群比例的影响 Figure 1 Effect of GLP on immunocytes subsets proportion in mice spleen analyzed by flow cytometry

图选项

采用流式细胞仪分析外周血中淋巴细胞。顺铂组可明显减少外周血中CD8⁺T、CD4⁺T、CD49b⁺NK、CD11b⁺MDSC和CD11c⁺DC细胞含量，并且CD4⁺T细胞含量显著减少19.2%。给予灵芝多糖用药后，CD8⁺T、CD4⁺T、CD49b⁺NK和CD11c⁺DC细胞含量均有不同程度的增高，但未能达到0.9%氯化钠溶液组细胞含量水平。而CD11b⁺MDSC细胞含量较顺铂组相对降低1.56%，见图 2。从结果中可看出，灵芝多糖可增强荷瘤鼠化疗后血液中相关淋巴细胞，进而增加体液免疫作用，恢复肿瘤对小鼠体液免疫的抑制。

1: normal saline group; 2: cisplatin group; 3: cisplatin +GLP group 图 2 流式细胞术分析灵芝多糖对小鼠外周血免疫细胞亚群比例的影响 Figure 2 Effect of GLP on immunocytes subsets proportion in peripheral blood of mice analyzed by flow cytometry

图选项

ELISA测定灵芝多糖对荷瘤小鼠外周血中IL-10、VEGF、TGF-β、IL-2和TNF-α 的含量变化情况。结果显示，顺铂组IL-10、VEGF、TGF-β、IL-2的含量均较0.9%氯化钠溶液组明显减少（P < 0.05），而TNF-α的含量则显著增多。给予灵芝多糖灌胃后，IL-10、VEGF、TGF-β、IL-2和TNF-α相对顺铂组又明显增多（P < 0.05），而IL-2的含量升高显著，与各组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），见图 3。

(1): P < 0.05,compared with normal saline group; (2): P < 0.05, compared with cisplatin group 图 3 ELISA检测小鼠外周血中相关免疫因子含量 Figure 3 The production of related immune factors in peripheral blood of mice examined by ELISA

图选项

RT-PCR检测结果显示，与0.9%氯化钠溶液组比较，顺铂组和顺铂+灵芝多糖组IL-2和TNF-α mRNA的表达水平明显增多（P < 0.001），顺铂+灵芝多糖组的IL-2和TNF-α mRNA表达水平明显高于顺铂组，差异有统计学意义（P < 0.001，P < 0.05），见图 4。

1: normal saline group; 2: cisplatin group; 3: cisplatin +GLP group 图 4 RT-PCR及Western blot检测小鼠脾细胞IL-2和TNF-α 的表达 Figure 4 Expression of IL-2 and TNF-α in mice splenocytes analyzed by RT-PCR and Western blot

图选项

20世纪90年代，肿瘤抗原的发现以及作为专职抗原提呈细胞的树突状细胞体外扩增技术的建立，大大推动了获得性抗肿瘤免疫，特别是T细胞抗肿瘤免疫的蓬勃发展，被认为可以用于清除以及控制肿瘤。然而，大量临床试验效果均不理想，直接导致了对肿瘤免疫更深层次的思考，表现为近些年来对肿瘤免疫抑制的集中研究，并在此基础上将肿瘤免疫监视理论升华为肿瘤免疫编辑理论，后者认为肿瘤和免疫的相互作用包括肿瘤免疫监视、肿瘤免疫平衡以及肿瘤免疫逃逸三个阶段^[3]。尽管前两个阶段免疫系统对肿瘤发挥杀伤作用，但进入第三个阶段，免疫则对肿瘤产生促进作用。目前所知，肿瘤免疫逃逸机制包括：肿瘤抗原的突变或缺乏；肿瘤细胞表面受体信号分子的改变；免疫抑制性细胞因子的生成，如血管内皮生长因子（VEGF），白介素-10（IL-10），前列腺素E2（PGE2），白介素-2（IL-2)，转化生长因子-β（TGF-β）；抗原提呈细胞分化、成熟、迁移异常，功能缺陷^{[4, 5]}。

肿瘤免疫逃逸阶段，肿瘤组织中大量聚集抑制性免疫细胞群，主要为髓源性抑制细胞（myeloid derived suppressor cell,MDSC）和调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）。以Dr. Bronte（Padua大学）和Dr. Ostrand-Rosenberg（Maryland大学）等为代表的学者在肿瘤MDSC方面进行了10多年的开创性研究，并发展至目前成为肿瘤免疫研究的热点与重点^{[6, 7, 8, 9]}。

自20世纪70年代以来，国内外学者均重视灵芝的抗肿瘤作用。Miyazaki等^[10]从灵芝子实体中分离出一种Mr为40 000的水溶性多糖（GL-1），小鼠腹腔注射共10天，发现有抑制S-180肉瘤的作用。张晓春等通过对鸡胚囊膜血管生成模型的研究，证实灵芝多糖可以抑制肿瘤血管的生成^[11]。现已知灵芝多糖类化合物和灵芝三萜类化合物是灵芝的关键药效成分。能增强机体的免疫功能，如增强小鼠迟发型过敏反应、促进淋巴细胞增殖反应、增强细胞毒T细胞的功能、增强巨噬细胞的吞噬功能、促进IL-1、IL-2和IL-6的生成等，故推测灵芝的抗肿瘤作用可能是由机体免疫系统介导的^[12]。

本研究中可见，灵芝多糖可增加荷瘤鼠脾脏和外周血中相关免疫细胞CD8、CD4、NK和DC细胞，这些因子都是T淋巴细胞，CD4为T辅助细胞，CD8为T杀伤细胞，通过体液介导发挥免疫作用，并且能同时减少MDSC细胞含量。MDSC是造血干细胞向髓系分化时所产生的一群高度异质的不成熟的髓性细胞。机体在正常状态下，骨髓仅含极低比例的Gr-1⁺和CD11b⁺的不成熟髓性细胞（Gr-1和CD11b 双阳性被广泛用于标记MDSC），且其几乎不具备抑制功能，但在肿瘤和其他慢性炎症情况下，MDSC在骨髓、脾脏、炎症部位大量聚集，通过多种机制发挥免疫抑制作用^[13]。有文献报道，应用香菇多糖后可使小鼠脾脏内TNF-α、IL-2和IL-6因子水平均升高，可刺激MHC-Ⅱ类抗原表达，同时促使荷瘤鼠脾脏组织中NK细胞的含量增加，共同杀伤肿瘤细胞^[14]。因此表明，灵芝多糖能提高小鼠免疫抑制作用可能与促使脾脏和外周血相关淋巴细胞含量增多及血液中免疫抑制因子的释放增加，进而增强免疫逃逸作用，提高免疫能力。