文章信息
- 陈帅,胡卫列,欧阳可育,聂奇伟,王尉. 2015.
- CHEN Shuai, HU Weilie, OUYANG Keyu, NIE Qiwei, WANG Wei. 2015.
- 沉默PCAF基因抑制人肾上腺皮质癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的实验研究
- Inhibitory Effect of Silencing PCAF Gene on Growth and Angiogenesis of Human Adrenocortical Carcinoma Xenograft in Nude Mice
- 肿瘤防治研究, 2015, 42(05): 454-458
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42 (05): 454-458
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2015.05.007
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文章历史
- 收稿日期:2014-09-19
- 修回日期:2014-11-25
2.510010 广州, 广州军区广州总医院泌尿外科
2. Department of Urology, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010, China
肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma,ACC)的年发病率为(0.5~2)/100万,占所有恶性肿瘤的0.02%[1, 2]。该肿瘤的恶性程度高,侵袭力强,早期确诊率较低。P300/CBP相关因子(P300/CBP associated factor,PCAF)属于乙酰基转移酶家族成员,其参与的组蛋白乙酰化是最重要的表观遗传学修饰之一,与肿瘤的发生有着密切的联系[3]。我们前期研究[4]发现,PCAF在肾上腺皮质癌中呈高表达。本实验通过构建稳定下调PCAF表达的肾上腺皮质癌细胞株,建立裸鼠肾上腺皮质癌模型,观察各组肿瘤生长情况,检测裸鼠瘤体组织中血管内皮生长因子的表达情况和肿瘤微血管密度值,旨在探讨沉默PCAF表达对ACC肿瘤生长及血管生成的干预作用机制,为开展临床实验提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料人肾上腺皮质癌SW13细胞株,购自中国科学院上海生物细胞研究所。Balb/c雌性裸鼠,4周龄,购自广东省实验动物中心。人pLenti6.3-MiRNA-PCAF慢病毒表达载体由广州life基因有限公司制备合成:人pLenti6.3-MiRNA-PCAF及pLenti6.3-MiRNA-NC阴性对照组(碱基序列随机排列,与人类基因的外显子无同源性)慢病毒载体系统由pcDNA6.3载体、pDONR221载体、pLenti6/V5-DEST载体三质粒组成,携带荧光蛋白(GFP),滴度为7.5×108TU/ml。PCAF、VEGF(美国Santa Cruz公司),CD31(美国Novus公司),二抗(鼠兔通用型,丹麦Dako公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(中国碧云天),反转录试剂盒、SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒(美国Roche公司)。
1.2 方法 1.2.1 慢病毒感染SW13细胞取对数生长期SW13细胞,以每孔4.0×105个细胞接种于6孔板,培养于含10%胎牛血清的Leibovitz-15细胞培养液中,置CO2、37℃饱和湿度的培养箱培养,用锥虫蓝染色法计算细胞成活密度约30%~40%时,加入以感染复数MOI为100病毒量进行感染,此时效果最佳,24 h后换液培养,72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况及细胞状况,GFP基因由慢病毒骨架质粒所携带,如细胞表达绿色荧光蛋白提示成功被重组慢病毒感染,并取感染效率大于90%细胞用于裸鼠成瘤实验。
1.2.2 移植瘤裸鼠模型的建立将15只裸鼠随机分为三组,每组5只:实验组、阴性对照组及空白对照组。分别取SW13细胞及相应的病毒感染后的SW13细胞,胰酶消化后,制成SW13单细胞悬液,调整细胞密度为1×107个/ml,每只裸鼠皮下接种0.1 ml单细胞悬液于右侧腋下;每3天用卡尺测量并记录瘤体的长径和短径,按公式:体积(V)=1/2长径(a)×短径(b)2绘制肿瘤生长曲线。依据公式P=(对照组瘤体积-实验组瘤体积)/对照组瘤体积×100%计算抑瘤率。皮下接种后第32天处死全部裸鼠,测量种植瘤瘤体,肿瘤组织部分保存于液氮,部分用10%中性甲醛溶液固定后行HE染色及免疫组织化学检测,本动物实验过程严格遵循伦理学规范。
1.2.3 荧光定量PCR法检测移植瘤组织PCAF mRNA表达TRIzol法分别提取三组肿瘤组织总RNA,按照试剂盒说明完成第一条链cDNA的合成。荧光定量PCR引物序列:PCAF上游引物:5’-AACAGTGAAGACGAGCGAAGC-3’,下游引物:5’-CGATCTCCCAATGATGATGATATTTCTG-3’;β-actin上游引物:5’-GGGAAATCGTGCGT-GACATTAAGG-3’,下游引物:5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTC-3’;反应条件:95℃ 10 min,95℃ 15 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,共40个循环;依据荧光曲线,计算出Ct值,基因mRNA相对表达量采用2-ΔΔCT法进行计算分析。
1.2.4 Western blot检测常规方法抽提组织总蛋白,经BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白质定量,等量的总蛋白样品(每孔40 μg)行10% SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳,PCAF与β-actin一抗为SantaCruz公司产品,辣根过氧化物酶和小鼠二抗购自美国Sigma公司。采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描后行灰度分析。
1.2.5 移植瘤组织HE染色移植瘤组织经石蜡包埋后,5 μm连续切片,经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水处理后,苏木素-伊红染色,中性树胶封片,显微镜下观察组织形态。
1.2.6 免疫组织化学SP法检测瘤组织内微血管密度及VEGF表达情况石蜡切片组织常规处理至血清封闭后,分别滴加CD31和VEGF一抗,37℃孵育60 min,PBS洗涤3 min/次,滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG,PBS洗涤3 min/次,DAB显色,显微镜下控制显色,苏木精对比染色,脱水、透明、封片。选取有代表性的组织切片,排除肿瘤出血坏死区及边缘反应区,按照Weidne等[5]提出的标准,40倍镜下确定切片中血管密度最高的区域,然后100倍镜下计数5个视野中肿瘤内微血管数目。VEGF阳性判定:以细胞质着色,染色呈棕黄为阳性,胞质无着色或着色浅为阴性。未见阳性细胞为阴性(-);阳性率 < 30%为阳性(+);阳性率≥30%为强阳性(++)。
1.3 统计学方法测定值以均数±标准差表示,SPSS13.0统计软件对数据进行分析,两组间比较采用t检验分析,多组组间比较采用方差分析,等级资料采用秩和检验,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 移植瘤模型建立及生长情况以MOI=100为病毒量感染SW13细胞72 h后感染效率达90%以上,见图 1,筛选出稳定细胞株用于裸鼠实验,见图 2。经皮下注射未转染的SW13细胞、(pLenti6.3-MiRNA-NC)SW13细胞和(pLenti6.3-MiRNA-PCAF)SW13细胞后,三组裸鼠的成瘤率均为100%。三组荷瘤裸鼠之间瘤体积自第17天开始差异出现统计学意义(P=0.043),正常组和阴性对照组的瘤体生长速度相近(P=0.198),PCAF下调组瘤体生长曲线最为平缓,见图 3。至注射后第32天,正常组瘤体平均体积为(1 889.04±627.67)mm3,阴性对照组瘤体平均体积为(1 750.00±593.52)mm3,PCAF下调组瘤体平均体积为(889.08±353.60)mm3,明显小于正常组和阴性对照组,差异有统计学意义(P=0.0001)。
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图 1 荧光显微镜下慢病毒感染72h后SW13细胞(×40) Figure 1 SW13 cells infected by lentivirus after 72h observed by fluorescence microscope (×40) |
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图 2 倒置显微镜下稳定转染后的SW13细胞(×40) Figure 2 Stable screening SW13 cells observed by inverted microscope (×40) |
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图 3 三组荷瘤裸鼠的瘤体生长曲线 Figure 3 Tumor growth curves of three groups |
与对照组相比,实验组的PCAF蛋白表达减弱,经过对其灰度分析后显示对PCAF基因进行基因干扰后可下调约58.4%的蛋白表达(P=0.02),见图 4。
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explainnoteps 图 4 Western blot检测各组中PCAF蛋白表达 Figure 4 Expression of PCAF protein detected by Western blot |
实验组的PCAF mRNA表达量显著低于正常组和阴性对照组,沉默治疗可下调约74.3% PCAF基因的表达,实验组与对照组差异具有统计学意义(P=0.02),两对照组间差异无统计学意义(P=0.224),见图 5。
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图 5 qPCR法比较三组间PCAF mRNA的表达 Figure 5 Comparison of PCAF mRNA expression in three groups detected by qPCR |
对照组肿瘤组织血管丰富、细胞量多、核/质比例大、染色深、核分裂相多见、癌巢大、细胞丰富、排列紧密、间质稀少,包膜多不完整,相反PCAF下调组肿瘤组织血管较少、细胞量较少、分界清、癌巢小、间质丰富,包膜相对完整,见图 6。
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A: less mitotic figures and less microvessels in pLenti6.3-MiRNA-PCAF group; B: while tumor cells grew well,and more mitotic figures and more microvessels in pLenti6.3-MiRNA-NC; C: PBS group 图 6 裸鼠皮下移植瘤组织形态 (HE×200) Figure 6 Morphological change of xenograft tumors in nude mice (HE×200) |
VEGF阳性表达主要定位于细胞质,为黄色或棕褐色颗粒。PCAF下调组的VEGF蛋白表达水平较对照组显著降低,差异有统计学意义(P=0.042,P=0.049);正常组和阴性对照组的VEGF表达差异无统计学意义(P=0.576),见图 7。不同区域的微血管计数不同,形态不规则,部分血管无明显管腔,PCAF下调组的MVD值(19.4±4.2)明显低于阴性对照组(42.7±6.5)和正常组(51.3±8.6),组间比较差异有统计学意义(P=0.005),见图 8。
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A: a few VEGF positive cells(brown) in pLenti6.3-MiRNA-PCAF group; B: plenty of VEGF positive cells(brown) in pLenti6.3-MiRNA-NC; C: PBS group 图 7 各组移植瘤组织VEGF免疫组织化学染色(×200) Figure 7 Immunohistochemical staining of VEGF in xenograft tumor tissues in nude mice (×200) |
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A: a few number of CD31 positive cells(brown) in pLenti6.3-MiRNA-PCAF group; B: an abundance of CD31 positive cells(brown) in pLenti6.3-MiRNA-NC; C: PBS group 图 8 各组移植瘤组织中MVD免疫组织化学染色(×200) Figure 8 Microvessel density (MVD) in xenograft tumors by immunohistochemistry (×200) |
肾上腺皮质癌是少见的泌尿系统恶性肿瘤,其恶性程度高,侵袭性强,治疗仍以根治手术为主,缺乏有效的药物治疗[6]。而PCAF作为HAT家族成员之一,通常存在于具有乙酰转移酶活性的复合物中,这些复合物通过使组蛋白和非组蛋白特定位点的赖氨酸残基(Lys)发生乙酰化来激活转录,与肿瘤的发生具有密切关系[7]。
肿瘤的生长扩散依赖于血管生成,其过程是肿瘤细胞、血管内皮细胞与其微环境相互作用的结果,涉及到多种细胞因子的参与。血管内皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前发现刺激肿瘤血管生长最重要且最直接的因子,在促进肿瘤微血管与微淋巴管生成中起着关键作用[8],并与多种肿瘤的生长、转移和预后有关[9]。而MVD能较准确地反映肿瘤血管形成的活跃程度,是影响肿瘤预后的重要因素[10],本研究中稳定转染pLenti6.3-MiRNA-PCAF细胞株后,下调PCAF表达对肿瘤血管形成起着显著的抑制作用,裸鼠皮下生长也受到显著抑制,与肿瘤细胞侵袭性密切相关的MVD明显降低,表明PCAF在肾上腺皮质癌肿瘤血管生成及侵袭性方面起着重要促进作用。
肿瘤组织缺氧状态是VEGF增多以致血管形成的最初启动因素。随着肿瘤不断增生、体积增大,仅靠周围的血供已不能满足其所需,从缺氧到VEGF表达量增多的过程中缺氧诱导因子-1(HIF-1)起到了桥梁作用,大量聚积的HIF-1作用于VEGF的启动子序列,通过激活VEGF转录,特异性地刺激内皮细胞增殖,促使肿瘤血管生成[11],而在缺氧条件下,PCAF通过乙酰化HIF-1α并激活其靶基因VEGF、survivin等,为细胞提供能量,促进细胞的增殖,调节血管生成及细胞凋亡[12]。Lim等[13]认为PCAF的乙酰化功能与去乙酰化酶SIRT1的去乙酰化共同作用于HIF-1α,调节在低氧状态下的细胞应答。在Rajendran等[14]研究中,具有HAT活性的PCAF可以干扰HIF-1α对SCO2及TIGAR基因的调控,表明在低氧状态下,PCAF的乙酰化作用是调节细胞能量产生的重要调控途径。本实验中,随着裸鼠移植瘤的生长,周围血供不足可引起组织缺氧,推测PCAF在此低氧环境下可能通过乙酰化HIF-1α使得VEGF表达增多,刺激内皮细胞增殖,VEGF可诱导血管新生,增加肿瘤细胞养分供应,促进肿瘤迅速增长。
大量研究表明,PCAF参与细胞的分化、凋亡及肿瘤形成过程,并在多种肿瘤组织或肿瘤细胞系中表达降低或不表达,包括食管鳞状细胞癌、乳腺癌、肝癌等[3, 15],但在前列腺癌、膀胱癌和肺癌[16, 17]的研究中发现PCAF存在高表达,并能促进肿瘤生长、侵袭以及化疗耐药性,故PCAF在肿瘤发生、发展中扮演的是促癌还是抑癌基因的角色,尚未形成统一的观点,但本研究可以初步证实PCAF在肾上腺皮质癌裸鼠模型中对于肿瘤生长、增殖、血管生成方面的促进作用,为进一步探讨PCAF在ACC发生发展的作用机制,奠定了良好的基础。
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