Lynch综合征（Lynch syndrome，LS）又称遗传性非息肉性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma，HNPCC），是一种常染色体显性遗传病，其发病率占结直肠癌发病率的2%~3%，是遗传性结直肠癌中常见的一种^[1]。 Lynch综合征分为LynchⅠ型（家系内只有结直肠癌遗传）及LynchⅡ型（家系内除了结直肠癌还有其他肠外恶性肿瘤遗传）。目前国际上Lynch综合征的诊断标准有多种，主要有AmsterdamⅠ标准、AmsterdamⅡ标准及Bethesda指南。研究认为Lynch综合征的发生与DNA错配修复基因（DNA mismatch repair，MMR：MLH1，MSH2，MSH6，PMS2）的胚系突变有关^{[2, 3]}。2013年NCCN结直肠癌指南提出了Lynch综合征的筛选流程：首先应用改良Bethesda指南来筛选患者，随后通过免疫组织化学法或微卫星不稳定检测方法来检测MMR基因表达状态。最后通过基因测序来进行验证，MMR基因突变检测是HNPCC诊断的金标准，同时还要排除APC基因的突变^[4]。本研究选择云南省7个Lynch综合征家系采用目标区域捕获结合高深度测序技术，确定此家系中所有家系成员MMR基因及APC基因的突变情况。1 资料和方法1.1 资料1.1.1 样本准备

选取昆明医科大学第一附属医院肿瘤科2008年3月—2013年12月收治的7个经过免疫组织化学法和微卫星不稳定检测确定为微卫星不稳定和MMR蛋白缺失的家系先证者，并且这7个家系都符合AmsterdamⅡ诊断标准。7个家系中白族家系2个、彝族家系2个、汉族家系3个。其中少数名族家系均追寻家系三代确定家系成员并未与其他民族通婚情况。1.1.2 详细询问家族史

绘制Lynch综合征家系图，并用系谱分析方法确认每个家系的遗传方式。获得先证者的详细临床及病理学资料包括：（1）确诊恶性肿瘤时的年龄、性别；（2）肿瘤发生的部位（包括肠外癌）；（3）病理分期。1.1.3 实验材料及设备

采用德国Qiagen全血DNA提取试剂盒进行DNA提取。特异性引物合成及测序由华大基因公司完成。 1.2 方法1.2.1 全血DNA提取

采用德国Qiagen全血DNA试剂盒提取全血基因组DNA，置于-20°C冰箱备用于突变基因检测。1.2.2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC基因检测

采用目标区域捕获结合高深度测序技术，对家系首发患者的遗传性结直肠癌相关5个基因外显子及其邻近±2 bp内含子区变异（包括点突变、SNP和移码变异、大片段杂合缺失、复制与倒位重排）进行分析。2 结果2.1 Lynch综合征家系的临床表型分析

7个Lynch综合征家系中，家系成员共102人，确证恶性肿瘤的共计29人，其中结直肠癌患者22例（包括同时性和异时性多原发性结直肠癌）。22例结直肠癌患者中有1例患有乙状结肠癌和胰腺癌，1例同时患有胃癌和结直肠癌。肠外恶性肿瘤共7例（子宫内膜癌2例、肺癌2例、乳腺癌2例、胃癌1例）。7个家系中行肠镜筛查，17例家系正常成员中有结直肠息肉的共计11人。29例恶性肿瘤患者中，男15例、女14例。22例结直肠癌发病部位：升结肠癌7例、横结肠癌1例、降结肠癌3例、乙状结肠癌2例、直肠癌9例；病理类型：黏液腺癌2例、腺癌20例。2.2 7个Lynch综合征家系临床分析2.2.1 家系A

（彝族家系）：共4代，有5位患者，2位男性患者、3位女性患者。患者Ⅰ-1（第一代的第一个家系成员）：60岁时死于升结肠癌；患者Ⅱ-1（第二代的第一个家系成员）：58岁时患升结肠癌；患者Ⅱ-2（第二代的第二个家系成员）：54岁时患子宫内膜癌，60岁时死于子宫内膜癌；患者Ⅱ-3（第二代的第三个家系成员）：50岁时患横结肠癌；患者Ⅲ-2（第三代的第二个家系成员）：38岁时患升结肠癌。2.2.2 家系B

（彝族家系）：共4代，有5位患者，2位男性患者、3位女性患者。患者Ⅰ-1：68岁时死于肺癌；患者Ⅱ-3：66岁时患直肠癌；患者Ⅱ-4：64岁时患乙状结肠癌；患者Ⅱ-5：61岁时患直肠癌；Ⅱ-6：50岁时死于直肠癌多发转移。后家系所有成员均行肠镜检测发现Ⅱ-1，Ⅲ-1均有肠道多发息肉。2.2.3 家系C

（白族家系）：共4代，有3位患者，2位男性患者、1位女性患者。患者Ⅰ-1:66岁时确诊直肠癌；患者Ⅱ-2:52岁时死于直肠癌；患者Ⅱ-6:42岁时患直肠癌；家系内20岁以上的家系成员行肠镜检测均发现结直肠多发息肉。2.2.4 家系D

（汉族家系）：共3代，有3位患者，2位男性患者，1位女性患者。患者Ⅰ-1：45岁时确诊子宫内膜癌，60岁确诊为升结肠癌；患者Ⅱ-1：51岁时确诊升结肠癌；患者Ⅱ-2：48岁时同时确诊为升结肠癌和胃癌。2.2.5 家系E

（汉族家系）：共3代，有3位患者，2位男性患者、1位女性患者。患者Ⅰ-1：42岁时确诊结肠癌（具体不详），72岁时再次确诊为降结肠癌（异时性多原发性结直肠癌）；患者Ⅱ-1：41岁时确诊降结肠癌；患者Ⅱ-4：25岁，确诊为降结肠癌；此家系Ⅱ-2、Ⅱ-3号患者行肠镜筛查未发现息肉。2.2.6 家系F

（汉族家系）：共5代，有4位患者，1位男性患者、3位女性患者。患者Ⅰ-1：70岁时死于肠癌（具体不详）；患者Ⅱ-1：62岁时确诊为乙状结肠癌；65岁确诊胰腺癌；患者Ⅱ-2：46岁死于肺癌；患者Ⅲ-3：30岁时确诊为升结肠癌。2.2.7 家系G

（白族家系）：共4代，有8位患者，5位男性患者、3位女性患者。患者Ⅰ-1：67岁时死于肠癌（具体不详）；患者Ⅱ-1：59岁时死于肠癌（具体不详）；患者Ⅱ-2：57岁死于肠癌（具体不详）；患者Ⅱ-3：55岁，死于肠癌（具体不详）；患者Ⅱ-4：54岁，死于胃癌；患者Ⅲ-2：45岁时确诊为乳腺癌；患者Ⅲ-3：43岁时确诊为乳腺癌；患者Ⅲ-4：42岁时确诊为直肠癌；家系中Ⅲ-5、Ⅳ-9肠镜筛查发现息肉。2.3 7个家系先证者的微卫星不稳定、MMR蛋白检测结果

7个家系的先证者均行免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）及微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）状态检测，见表 1。发现他们均为高度微卫星不稳定。

表 1 7个家系先证者IHC及MSI状态检测结果 Table 1 IHC and MSI test results of the seven Lynch probands

表选项

A家系先证者检测出MLH1基因的1个疑似致病突变c.398_399insA，Het（W54/M45），见表 2。对疾病无影响的良性多态性，见表 3。

表 2 7个家系先证者致病基因突变情况 Table 2 MLH1,MSH2,MSH6,PMS2 and APC gene mutation of the seven Lynch probands

表选项

表 3 7个家系意义未明突变及良性多态性突变情况 Table 3 Undetermined significance mutations of the seven Lynch probands

表选项

B家系先证者未发现已知致病突变。检出的对疾病无影响的良性多态性。此次基因检测中，未检测出与遗传性结直肠癌相关的5个基因的已知致病突变。后再次对B家系Ⅱ-5号患者进行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC基因检测，同样未检测出与遗传性结直肠癌相关的5个基因的已知致病突变。 2.4.3 家系C突变检测结果

C家系先证者检测出MSH2基因的c.1480 T>C（p.Ser494Pro，Het）意义未明的突变。另检出其他对疾病无影响的良性多态性，见表 2、3。 2.4.4 家系D突变检测结果

对D家系先证者在 MSH2基因上发现1个疑似致病突变 EX1_8 del,het。检出意义未明的突变及对疾病无影响的良性多态性。EX1_8 del，Het突变会导致MSH2基因1号至8号外显子缺失，进而影响其编码蛋白的结构及功能，这是一个新的突变，但考虑到此突变对蛋白质影响较大，因此判定为疑似致病突变，见表 2、3。 2.4.5 家系E突变检测结果

E家系先证者在MLH1基因上发现1个已知致病突变 c.1731 G>A（Het A74/73G）；另检出对疾病无影响的良性多态性，见表 2、3。2.4.6 家系F突变检测结果

F家系先证者检测出PMS2基因的1个意义未明突变 c.1262G>A,Het（A61/93G）。检出对疾病无影响的良性多态性，见表 2、3。2.4.7 家系G突变检测结果

G家系先证者未发现已知致病突变。检出对疾病无影响的意义未明的突变及良性多态性。 3 讨论

我国结直肠癌的发病率在恶性肿瘤发病中已位居第四位，正在逐渐接近欧美发达国家（位居第二位）的水平^[4]。最新研究认为，遗传因素是结直肠癌发病的重要因素之一，累及近20%的结直肠癌患者，且发病率和死亡率呈逐年上升趋势，因此，遗传性结直肠癌在结直肠癌体系中占有重要比例，它具有遗传性、高发性和肿瘤发生的多器官性的特点^{[2, 3, 4]}。Lynch综合征约占结直肠癌的2%~3%，呈家族性常染色体显性遗传。Lynch综合征的临床诊断标准很多，在不同人种的标准有很大差别，而且目前在不同国家的标准也很繁杂，目前HNPCC的诊断都是滞后性的被动诊断^[5]。

Lynch综合征具有发病年龄低常伴有肠外恶性肿瘤及多原发性结直肠癌等特点，临床预后较好，早期发现、早期治疗将极大改善患者的预后。Lynch综合征的临床诊断主要依靠家族史调查，根据 AmsterdamⅡ标准做出诊断，包括：（1）家族中至少有3例Lynch综合征相关的癌，如结直肠癌、子宫内膜癌、小肠癌、输尿管或肾盂癌等，其中1例应为其中2例的一级亲属；（2）至少有连续两代发病；（3）至少1例患者发病年龄小于50岁；（4）排除家族性腺瘤性息肉病。其中前三项是诊断Lynch综合征的必需条件。此研究中的7个家系均符合AmsterdamⅡ诊断标准^{[6, 7]}。

Lynch综合征与DNA错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）突变有着密切的关系。Lynch综合征家族中MLH1和MLH2基因突变约占 80%~90%，MSH6基因突变占15%，PMS2基因突变不到14%。但Lynch综合征的发生、发展确切机制仍未得到阐明，目前认为Lynch综合征是一个涉及多因素、多步骤、多基因改变的复杂过程，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活以及错配修复基因的突变等^{[8, 9]}。1895年Aldred Scott Warthin教授首次报道了一个具有癌症聚集的家系，并将这个家系命名为“G家系”。此后国外就有了Lynch综合征的相关报道，并开展了其流行病学、致病基因、诊断标准、治疗手段等方面的研究。国内关于Lynch综合征的研究起步较晚，20世纪末才开始出现临床报道，目前国内研究仍处于无序状态，家系收集缺乏标准和质量控制，MMR基因检测结果也存在地域差异^{[10, 11]}。

本研究检测了云南省不同民族的7个Lynch综合征家系基因检测，在A家系（彝族）先证者进行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC基因检测，检测出ML.1基因的1个疑似致病突变c.398_399insA,Het（W54/M45）。在受检者的MLH1基因中检测出突变 p.Leu135Thrfs*6（c.398_399 insA，Het），会导致MLH1基因编码区398和399位插入A碱基，并导致框移突变，从而导致编码蛋白在139位氨基酸提前终止。而正常情况下，此基因可编码756个氨基酸。MLH1基因编码蛋白的提前终止会影响编码蛋白的正常功能。同时该突变在健康对照者里出现的频率极低，综合判断，该突变是一个新的疑似致病突变位点，目前尚未有文献报道过此突变。B家系先证者（彝族）进行基因检测未检测出与遗传性结直肠癌相关的5个基因的已知致病突变。后再次对B家系Ⅱ-号患者进行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC基因检测，同样未检测出与遗传性结直肠癌相关的5个基因的已知致病突变。未检出这5个基因的突变并不能完全排除受检者罹患遗传性结直肠癌的风险，不排除在检测基因范围以外存在其他未知致病突变的可能。C家系先证者（白族）基因检测，检测出MSH2基因的c.1480 T>C（p.Ser494Pro,Het）意义未明突变。该突变导致MSH2基因的编码蛋白第494位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸。该突变在千人基因组数据库中频率为 0，同时该突变目前尚无相关文献报道，缺乏该变异的蛋白功能研究和临床意义评估，综合分析该突变是一个临床意义未明突变。对D家系先证者（汉族）进行基因检测，在 MSH2基因上发现1个疑似致病突变 EX1_8 del,het。此突变会导致MSH2基因1号至8号外显子缺失，进而影响其编码蛋白的结构及功能，这是一个新的突变，但考虑到此突变对蛋白质影响较大，因此判定为疑似致病突变。E家系先证者（汉族）检测结果提示在MLH1基因上发现1个已知致病突变 c.1731 G>A（Het A74/73G），这是一个同义突变，并不会导致氨基酸发生变化，但是该突变发生在15号外显子的最后一个碱基，有研究表明该突变会导致MLH1基因在15号外显子末端剪接发生异常，形成的mRNA不稳定，没有成熟的蛋白产物或者产生截短的蛋白质。有研究在符合临床诊断标准的遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）患者体内检出该突变，并认为是患者的致病突变。综上所述，该突变是一个已知致病突变。F家系先证者（汉族）检测出PMS2基因的1个意义未明突变 c.1262G>A，Het（A61/93G）。在受检者的P MS 2基因中检测出突变 p.Arg421Gln（c.1262G>A，Het），会导致PMS2基因编码蛋白第421位精氨酸变为谷氨酰胺，目前还没有此突变相关报道。SIFT预测其蛋白功能为无害，PolyPhen预测其蛋白功能为有害，此突变在健康者中出现的频率极低，是一个意义未明的突变。对G家系先证者（白族）进行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC基因检测，未发现已知致病突变。

云南省少数民族众多，具有不同民族遗传结构的多样性和民族背景的单一性，因此云南是中国遗传资源最为丰富的地区，是遗传学研究优质的样本群。本研究7个家系中有2个白族家系、2个彝族家系、3个汉族家系。在4个少数名族家系中均未发现已知致病突变，说明少数名族家系和汉族家系存在差异。