肺多原发癌发病率的提高主要因为诊断技术的进步和肿瘤患者生存期的延长，但在获得组织病理检查前的临床诊断主要来源于影像学判断，这必然导致肺多原发癌和转移癌鉴别诊断的困难和较低的准确性。研究表明肺多原发癌与转移癌患者的治疗方法和预后生存均不相同，经手术治疗的肺多原发癌患者可达到与原发肺癌患者手术治疗相似的疗效^[1]。因此临床上准确区分肺多原发癌与转移癌是制定正确治疗策略和评估预后的重要前提。临床确诊主要是应用组织病理和免疫组织化学的方法进行检测分析，而肿瘤组织常是在手术后才能获得，很少能在手术前得到明确的病理诊断。本实验通过检测转移癌、肺多原发癌和原发肺癌病例外周血单个有核细胞DNA损伤率及损伤程度，以初步探究外周血单个有核细胞DNA损伤在肺多原发癌与转移癌鉴别诊断的临床应用价值。1 资料与方法1.1 临床资料

研究对象为 2011年3月至2012年11月入住华西医院胸外科的初诊为肺癌、肺多原发癌、转移癌，且临床及随访资料齐全的87例患者，所有病例均行组织病理诊断和免疫组织化学基因差异再分析，一致性分析后证实的转移癌、肺多原发癌和原发肺癌。肺多原发癌组30例（多原发性肺癌15例，肺癌与其他脏器恶性肿瘤15例），其中男14例，女16例，中位年龄62.5岁（24~77岁）。

转移癌组28例，男13例，女15例，中位年龄59岁（42~73岁），其中10例肺癌伴远处器官转移，4例肺癌伴肺内转移（2例右肺上叶腺癌伴同肺叶转移，2例左肺下叶腺癌伴同肺叶转移），14例肺癌伴淋巴结转移（12例伴同侧纵隔淋巴结转移N2，2例伴同侧锁骨上淋巴结转移N3）。原发肺癌组29例，男16例，女13例，中位年龄63岁（37~82岁）；腺癌16例，鳞癌13例。按2009年UICC肺癌P-TNM分期分为：ⅠA期13例，ⅠB期16例。1.2 标本采集及处理

所有静脉血标本均用紫头采血管（含抗凝剂）采集并遮光保护，且在4℃温度环境下运送至实验室进行实验。1.3 微量全血单细胞凝胶电泳实验（彗星实验）

操作方法^{[2, 3]}制片：第1层凝胶制备：用微波炉加热溶解浓度为1%的正常熔点琼脂糖（NMA），再冷却至45℃~60℃，取适量NMA（100~200 μl）铺于载玻片上，立即盖上干净盖玻片，再置4℃下至少30 min使NMA 凝固。第2层凝胶的制备: 1%低熔点琼脂糖（LMA）在微波炉中加热使之完全溶化，冷却至37℃，移去盖玻片，将25 μl混匀的外周全血和475 μl的LMA 混匀，迅速将60 μl混匀的含细胞LMA 滴到第1层琼脂糖上，立即盖上干净盖玻片，4℃静置30 min 使第2层LMA 凝固。第3层凝胶的制备：移去盖玻片，取37℃恒温的1%低熔点琼脂糖LMA适量（50~100 μl），铺于第2层凝胶上，立即盖上干净盖玻片，再置4℃下至少30 min，使LMA 凝固。细胞裂解：移去盖玻片，将载玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的碱性细胞裂解液（pH10.0）。4℃下裂解过夜。取出载玻片，蒸馏水漂洗2次。

DNA碱解旋：倒入新配制的碱性电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25 cm左右，室温静置30 min。 细胞电泳：稳压20 V，电流295~300 mA，遮光电泳30 min。中和、染色：将载玻片置于平皿内，双蒸水漂洗2次，沿壁缓缓加入0.4 mol/L Tris·HCl （pH7.5） 缓冲液漂洗3次，每次5~10 min，弃去Tris-HCl并用滤纸吸干水分，自然晾干。每张载玻片加2~3滴染色剂（5 μg/ml的DAPI荧光染色剂），避光染色5 min。

观察、拍照和分析：荧光显微镜2 500~4 000 nm（蓝光）波长的激发光，可清楚地观察到细胞核DNA和迁移DNA（即慧星尾）。每个样本计数两张玻片，每张玻片计数50个细胞，共100个细胞。图片保存分析。1.4 观察指标

DNA损伤细胞阳性率：是指DNA受损细胞数占分析细胞总数的百分率，见图 1A、B。DNA损伤程度：分别以尾长（tail length）、尾矩（tail moment）和椭圆矩（olive moment）进行分析，见图 1C。尾长：即沿电泳方向“彗星”尾部最远端与头部中心间的距离，是损伤 DNA碎片的迁移长度。尾矩： 是指尾部 DNA占总DNA的百分比与头、尾部中心间距的乘积。椭圆矩：是以“彗星”头部中心点为零点，沿电泳方向将“彗星”按一定的间隔分成若干个区域（80个），分别测定每个区域荧光强度（Di ，代表该区域DNA量）、该区域中心至零点的距离（Xi）、“彗星”总荧光强度（Dt，代表总DNA量），则椭圆矩定义为Σ（Di×Xi ）/Dt。

A: normal cells; B: DNA damage cells; C: DNA damage measurements 图 1 外周血单个有核细胞DNA损伤及Casp图像软件分析结果Figure 1 DNA damage of peripheral blood mononuclear cells and Casp image analysis software analysis results

图选项

所有数据用SPSS21.0统计学软件进行数据分析，实验数据以百分率和均数±标准差表示，率的比较采用卡方检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 各组患者外周血单个有核细胞DNA损伤实验结果

随机选取荧光电子显微镜放大200倍情况下的单个视野，原发肺癌组某患者外周血单个有核细胞损伤阳性数有1个，见图 2A，肺多原发癌组某患者外周血单个有核细胞损伤阳性数有2个，见图 2B，而转移癌组某患者外周血单个有核细胞损伤阳性数可见有3个，见图 2C。

A: experimental result of primary lung cancer patients(×20); B: experimental result of multiple primary lung cancer patients(×20); C: experimental result of pulmonary metastatic carcinoma(×20); the arrows indicated DNA damage of peripheral blood mononuclear cells shown as “comet tail” in alkaline electrophoresis conditions 图 2 肺癌患者外周血单个有核细胞DNA损伤实验结果 Figure 2 Experiment results of DNA damage of peripheral blood mononuclear cells in lung cancer patients

图选项

2 8例转移癌患者外周血单个有核细胞损伤阳性率为6.29%（176/2 800）显著高于30例肺多原发癌组的3.77%（113/3 000），（χ²=18.883,P=0.000），30例肺多原发癌组外周血单个有核细胞损伤阳性率显著高于29例原发肺癌组的2.66%（77/2 900），（χ²=5.494,P= 0.019），见表 1。

表 1 各组患者外周血单个有核细胞DNA损伤率比较 Table 1 Comparison of peripheral nucleated cell DNA damage rate among three groups

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外周血单个有核细胞DNA损伤的尾长、尾矩和椭圆矩在转移癌患者组为[（44.19±13.48）μm、（4.53±1.66）和（4.64±1.50）]显著高于肺多原发癌患者组[（34.85±8.40）μm 、（3.30±1.04） 和（3.54±1.03）]，（P=0.000）。肺多原发癌患者组显著高于原发肺癌组[（26.25±7.64）μm 、（2.20±0.98） 和（2.37±0.78 ）]，（P=0.000），见表 2。

表 2 各组患者外周血单个有核细胞DNA损伤程度比较 Table 2 Comparison of peripheral nucleated cell DNA damage levels among three groups

表选项

关于如何准确鉴别诊断肺多原发癌和转移癌的问题，目前公认的诊断标准是2003年美国胸科医师学会（American college of chest physicians,ACCP）提出的肺多原发癌及转移癌的诊断标准，其中对于肺多原发癌也有一些新的认识^[4]。但现在的困难是手术前临床上难以得到组织标本，只能根据影像学表现进行判断。有研究表明肺癌患者相较于健康者有更高的自发染色体畸变率，其中肺癌患者的DNA单链损伤较多，且DNA损伤的修复能力较低^{[5, 6, 7, 8, 9]}。Orlow等^[10]研究进一步发现肺多原发癌患者外周血单个有核细胞DNA损伤程度显著高于原发肺癌患者，且DNA受损后的修复能力明显低于原发肺癌患者。因此，外周血单个有核细胞DNA损伤的检测可能有助于肺多原发癌和转移癌的鉴别诊断。

目前检测有核细胞DNA损伤的主要方法是单细胞凝胶电泳技术，又称彗星实验（comet assay）。该实验技术是Ostling等（1984年）首创，后经Singh等（1988年）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，能够灵敏地检测DNA断裂，在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有着广泛的应用价值^{[11, 12]}。该技术通常取静脉血,并从中分离、富集淋巴细胞用于实验。但这一方法因需血量大、实验步骤较多，制约了彗星实验在生物监测中的广泛应用。为此我们选择改进后的实验方法^{[2, 3]}，即采用患者外周全血直接进行实验，与传统方法比较不仅能得到相同的实验准确度、灵敏度，还具有更简便、快速，且更具有临床检验可行性的特点。

本研究运用单细胞凝胶电泳技术对2 8例转移癌、30例肺多原发癌和29例原发肺癌患者外周血单个有核细胞DNA损伤率和损伤程度进行分析。研究结果表明转移癌组外周血单个有核细胞损伤阳性率为6.29%（176/2800）显著高于肺多原发癌组3.77%（113/3000），（χ²=18.883,P=0.000）；肺多原发癌组显著高于原发肺癌组2.66%（77/2900），（χ²=5.494,P=0.019）。说明外周血单个有核细胞DNA损伤和损伤修复能力降低的患者具有较高的肺癌易感性，肺癌患者DNA损伤程度的加重和DNA损伤修复能力的进一步降低将使其发展成为肺多原发癌或转移癌的风险增加。本实验结果显示转移癌组外周血单个有核细胞DNA损伤的尾长、尾矩和椭圆矩分别为[（44.19±13.48）μm、（4.53±1.66）和（4.64±1.50）显著高于肺多原发癌组[（34.85±8.40）μm、（3.30±1.04）和（3.54±1.03）]，（P=0.000）；肺多原发癌组显著高于原发肺癌组（26.25±7.64）μm 、（2.20±0.98） 和（2.37±0.78），（P=0.000）。这可部分说明随着肺癌病程的发展，外周血DNA损伤程度高的发展成为转移癌的可能性大。而DNA损伤相对较低的发展成为肺多原发癌的可能性较大。因此，外周血单个有核细胞DNA损伤程度分析可在肺癌患者再次出现多发恶性肿瘤（非弥漫性肿瘤）时提供部分鉴别诊断意义。在肺癌患者长期随访过程中，外周血单个有核细胞DNA损伤程度分析对患者可能发展成肺多原发癌或转移癌也具有一定的预测价值。

本实验用诊断后的病例样本来评估外周血DNA损伤在鉴别诊断肺多原发癌和转移癌的临床应用价值，这并不是特别理想的方法。因此，对更大规模的病例进行年龄、性别、吸烟史、肿瘤病理类型亚组分析及对一定数量肺癌患者进行前瞻性的研究将进一步明确外周血单个有核细胞DNA损伤分析的临床应用价值。

总之，本研究初步探讨了外周血单个有核细胞DNA损伤在鉴别诊断肺多原发癌和转移癌中的临床应用价值，希望今后的研究将DNA损伤具体量化，进一步研究外周血和肿瘤组织标本DNA微卫星不稳定性在鉴别肺多原发癌和转移癌中的价值，研究外周血和肿瘤组织标本的基因表达谱变化以及分析这三种方法在诊断肺多原发和转移癌与组织病理学检查的一致性，最终确立简便易取的外周血检测在鉴别诊断肺多原发和转移癌中的准确性和实用价值，在临床治疗前减少对肺多原发癌患者的误诊，让更多肺多原发癌患者早期接受以手术为主的根治性治疗，从而使筛查出的肺多原发癌患者获得更高的生存率和更好的生存质量。