近年一些研究显示，白血病也是一种血管新生依赖性肿瘤，在初发和复发白血病患者骨髓中发现 有明显血管新生现象。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）作为最重要的促血 管生成因子之一，在实体瘤的发生、发展及转移过 程中起着重要作用。近年的研究显示，在各类血液系 统恶性肿瘤中均有VEGF的高表达 ^[1,2]。结缔组织生长 因子（connective tissue growth factor,CTGF）是一种 即刻早期反应基因，与肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管的 新生相关 ^[3]。两者在急性白血病骨髓血管新生中是否 有协同作用？其表达水平与哪些因素相关？在治疗 前后会有哪些变化及意义？针对这些问题，我们对71 例急性白血病患者治疗前后骨髓中VEGF-C、CTGF mRNA进行检测分析，报告如下。 1 资料和方法 1.1 研究对象

初发急性白血病71例，为包头医学院第一附 属医院血液科2010年1月至2013年6月住院患者。 男 38例，女33例，年龄2~82岁，平均年龄45岁， 均依据诊断标准^[4]，根据临床表现、血象、骨髓 象、细胞化学染色、细胞遗传学及流式细胞术检 查确诊。其中急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）患者46例，急性淋巴细胞白血 病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者25 例。71例患者于我院行1周期治疗，AML患者行以 DA方案为主的方案化疗（其中M3患者加用亚砷酸 +维A酸诱导化疗），ALL患者行以VDLP方案为主 的方案化疗。于开始治疗的第28~30天，复查骨髓 穿刺，并同时留取骨髓液。疗效标准参照张之南 主编的《血液学诊断及疗效标准》^[4]。其中达完全 缓解（CR）者49例（AML31例，ALL 18例），部 分缓解（PR）者9例（AML 6例，ALL 3例），未 达缓解（NR）者13例（AML 9例，ALL 4例）。 对照组（Control group）共30例，为同期我院门 诊及住院的缺铁性贫血患者。男性16例，女性14 例，年龄17~69岁，中位年龄42岁。

对照组选取标准：（1）肝肾功能无异常； （2）近期没有感染性疾病，检查前24 h内体温无 异常；（3）无免疫性疾病及其它肿瘤性疾病； （4）无特殊用药史（糖皮质类激素、抗精神病类 药物及免疫抑制剂等）。 1.2 主要仪器

Ⅱ-2型生物安全柜，Xiang Yi H-1850R高速低温离 心机，PCR system 9700，DYY-2稳压稳流电泳仪等。 1.3 主要试剂

RNA提取试剂盒：离心柱型，目的基因CTGF、 VEGF-C及内对照引物均由上海生工公司合成。 1.4 方法与操作

1.4.1    标本采集 局部无菌操作进行骨髓穿刺，用 无菌注射器抽取骨髓液2 ml，以5%EDTA干粉管抗 凝。标本采取后立即提取单个核细胞，整个提取于 采集到骨髓液半小时内处理完，于-80℃冰箱保存。

1.4.2    TRIZOL提取RNA，按说明书进行操作。

1.4.3     RT-PCR实验（1）引物的设计，见表 1。 （2）两步法 Real-time PCR。依照试剂盒说明书 进行操作，将所得RNA取5 µl 行 2%琼脂糖凝胶电 泳，检测样本RNA的纯度。其余置于-70℃冰箱备 用。用目的基因VEGF-C、CTGF及内对照β-actin 特殊引物进行PCR扩增，所获得的结果经琼脂糖 凝胶电泳后，于紫外分光光度仪下观察，以 PCR Marker的位置判断目的产物，扩增出与目的片段 相同的片段，长度分别为115、100和240 bp。拍照 后进行面积灰度扫描，以密度代表其表达量，计 算出目的基因的相对表达量：目的基因的相对表 达量＝目的基因的密度/β-actin 的密度。

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence

表选项

所有数据均经SPSS11.5统计软件包处理，计 量资料采用均数±标准差表示，根据资料的性质 不同，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及配对样本t检验（Pair t-test）；相关分 析采用双变量相关分析（Bivariate correlation），以 P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 初发急性白血病患者临床特征与VEGF-C、 CTGF mRNA的表达情况及分析

2.1.1      按性别、年龄、骨髓增生程度、是否伴髓外 浸润进行分组，见表 2。比较VEGF-C、CTGF mRNA 表达情况，结果显示，伴髓外浸润组与未髓外浸润 组间比较差异有统计学意义，髓外浸润组表达明显 升高（P<0.05）；CTGF mRNA在骨髓增生不同程度 各组急性白血病比较差异有统计学意义，且随增生 程度上升，其表达水平呈上升趋势；而按性别、年 龄分组，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表 2 71例初发急性白血病患者临床资料 Table 2 The clinical data of the 71 patients with primary acute leukemia

表选项

2.1.2      对71例初发白血病患者VEGF-C、CTGF mRNA表达水平进行相关性分析，两者之间呈正 相关（r=0.709、P<0.05）。

2.1.3      其他相关因素 VEGF-C、CTGF mRNA表达水平与骨髓原始细胞比例、外周血白血病计 数、血小板计数未见明显相关性。 2.2白血病治疗前后骨髓中VEGF- C、CTGF mRNA表达情况

2.2.1    初发急性白血病患者骨髓中VEGF- C、 CTGF mRNA表达明显高于对照组（P分别为 0.000、0.001），其中AML组及ALL组与对照组 比较差异有统计学意义（P均为0.000），而两组 之间比较，差异无统计学意义（P分别为0.482、 0.378），见表 3。

2.2.2    71例急性白血病患者经1周期化疗后，完全 缓解者49人，部分缓解者9人，未达缓解者13人。 治疗后各组患者骨髓中VEGF-C、CTGF mRNA表 达与对照组比较，差异均有统计学意义（P分别为 0.015、0.041、0.001）。治疗后各组患者骨髓中 CTGF mRNA表达与对照组比较，差异均有统计学 意义（P分别为0.000、0.030、0.003）。VEGF-C mRNA表达在完全缓解组、部分缓解组与未缓 解组比较，差异有统计学意义（P分别为0.000、 0.009）。CTGF mRNA表达在完全缓解组、部分 缓解组与未缓解组比较，差异有统计学意义（P分 别为0.031、0.046），见表 3。

表 3 71例急性白血病患者治疗前后VEGF、CTGF mRNA 表达及与对照组的比较 Table 3 Co mpa ris o n o f VEGF a nd CTGF mRNA expression level before and after therapy between acute leukemia group and control group

表选项

2.2.3    应用配对样本t检验对急性白血病患者化 疗前后骨髓中VEGF-C、CTGF mRNA表达情况 进行比较，完全缓解患者及部分缓解患者与未 治疗时比较，差异有统计学意义（P<0.05）， 未缓解患者与初发时比较，差异无统计学意义 （P>0.05），见表 4。

表 4 71例初发急性白血病患者临床资料 Table 4 The clinical data of the 71 patients with primary acute leukemia

表选项

VEGF作为特异性血管通透诱导因子和内皮细胞有丝分裂原，主要通过与内皮细胞表面的FLF-I 和KDR受体结合，在血管新生中发挥重要作用， 它在肿瘤的增殖、浸润和转移中起主要作用，并 成为肿瘤预后的一项重要指标^[5]。Veikkola等^[6]研 究证实，VEGF和VEGFR结合，促进白血病细胞 或细胞系自身受体VEGFR的磷酸化，引起恶性血 液细胞调亡抑制基因表达，促进存活、增殖和浸 润。国内王志敏等^[7]采用免疫组织化学技术检测慢 性髓细胞白血病骨髓单个核细胞VEGF蛋白水平， 发现在各期中均高表达。沈慧玲等^[8]采用RNA干 扰技术沉默耐药白血病细胞VEGF的表达，发现可 以增强白血病细胞对化疗药物阿霉素的敏感度。 CTGF是一种有效的血管生成因子，Hall-Glenn等^[9] 揭示出CTGF在血管新生发生中的作用，详细分析 了CTGF如何介导血管内皮细胞与外膜细胞相互作 用。此外，CTGF也调节血管形成中内皮细胞基底 膜形成。Chang等^[10]研究发现，CTGF的反义寡核苷酸和反义RNA均可抑制内源性CTGF引起的血管 内皮细胞增殖和游走，从而抑制血管形成。CTGF 的表达与多种恶性肿瘤的发生、进展、肿瘤血管 生成、转移及预后密切相关^[11,12]。

本研究发现，初发急性白血病患者骨髓中均 存在VEGF-C、CTGF mRNA高表达，且其表达 与髓外浸润及骨髓增生程度具有一定相关性。经 治疗，即使短期内达缓解，仍存在其高表达， 与对照组比较仍有差异，这可能与急性白血病血 管过度增生及存在微小残留有关。由此推测， VEGF-C、CTGF参与了白血病的发生、浸润及 转移，并且与白血病预后相关。肿瘤血管生成是 一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基 质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮 细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜 等步骤。本研究显示，VEGF-C和CTGF mRNA 在初发急性白血病患者骨髓中表达呈正相关 （P<0.05），相关系数r=0.709，考虑急性白血病 骨髓血管新生过程中，两者可能存在某种协同作 用。本研究还发现，VEGF-C、CTGF mRNA表达 与骨髓原始细胞比例、外周血白血病计数未见明 显相关性。可以推测，VEGF-C、CTGF的表达并 不是白血病细胞本身所特有。血管生成过程中需 要血管内皮细胞（EC）与细胞外基质间、EC与EC 间及EC与其他周围细胞间的相互作用。一方面肿 瘤细胞释放血管生成因子激活EC，促进EC的增殖 和迁移，另外一方面内皮细胞旁分泌某些血管生 长因子刺激肿瘤细胞的生长。

综上所述，VEGF-C、CTGF共同参与了白血 病骨髓血管生成，两者协同促进白血病发展、浸 润及转移，这方面的进一步研究，将有助于了解 白血病发病及髓外浸润机制。由于病例数有限， 各类型白血病病例数不均衡，达不到统计学要 求，未能对具体类型白血病进行比较分析，今后 工作中，会进一步增加病例数，并且观察长期缓 解患者体内上述因子的变化，为白血病的抗血管 新生治疗理论提供一些依据。