肿瘤细胞是在机体持续的选择压力下形成的，具有全方位逃避免疫识别的特征。免疫系统对肿瘤实行抵抗、塑形和选择，而肿瘤则经过免疫清除、相持和逃逸三个阶段逃避免疫监视^[1]。肺癌是常见恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌总数的80%，传统的治疗模式如手术、放化疗可有效降低肿瘤负荷，但由于放化疗的严重不良反应、肿瘤细胞的耐药、肿瘤干细胞的存在以及肿瘤患者的免疫功能紊乱等诸多因素使治疗方案的实施和肿瘤患者的获益受到极大的限制^[2]，亟待探索新的治疗模式应用于NSCLC的治疗。

过继性免疫治疗是肿瘤生物治疗的一种有效方法^[3]。细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer，CI K）细胞是经体外培养的一群异质性细胞，兼具有T淋巴细胞的杀瘤活性和自然杀伤（natural killer，NK）细胞的非主要组织相容性复合体（major histocompatibility comples，MHC）限制性杀瘤特点，在恶性肿瘤中的治疗效果得到广泛认同。免疫逃逸是恶性肿瘤细胞的重要特征之一，调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）在肿瘤免疫逃逸中起主导作用，可通过多种机制抑制免疫效应细胞的功能^[4]。有关肾癌及肺癌的研究表明，多次CIK细胞输注治疗可延长转移性肾癌及肺癌患者的总生存期及无疾病进展时间^{[5, 6]}。本研究通过观察3次CIK细胞治疗后与治疗前相比NSCLC患者T细胞亚群的变化及一般情况的改变，探讨CIK细胞治疗对NSCLC患者免疫功能的影响。1 资料与方法1.1 临床资料

选取2012年8月—2014年3月间河北医科大学第四医院生物治疗科收治的NSCLC患者80例，所有患者均接受过放化疗和（或）手术等规范化治疗，且第1次CIK细胞输注治疗距离末次治疗时间均超过1月。患者中位年龄63岁（49~78岁），其中男54例、女26例。按照国际肺癌研究协会（IASLC）第七版标准进行TNM分期：Ι期10例（12.5%）、Ⅱ期24例（30%）、Ⅲ期28例（35%）、Ⅳ期18例（22.5%）；病理组织学分型：鳞癌28例、腺癌50例、腺鳞癌2例。KPS评分均>90分。选择门诊健康体检者20例为对照组。CIK细胞治疗方案经过医院伦理委员会批准，患者及志愿者均签署知情同意书。1.2 主要试剂及仪器

纤维连接蛋白、抗CD3单克隆抗体购于北京宝日医生物技术有限公司；γ干扰素购于德国美天旎生物技术公司；人外周血淋巴细胞分离液购于天津市川页生物制品有限公司；重组人IL-2购于山东泉港药业有限公司；流式细胞检测所用免疫荧光抗体CD4-FITC、CD3-FITC、CD8-PE、CD3-ECD、CD19-PE、CD56+CD16-PE、CD25-PE、Foxp3-ECD及破细胞膜剂PerFix-nc Kit均购于Beckmon Coulter公司。流式细胞检测仪为Beckmon Coulter XL型购于美国Beckmon公司。1.3 CIK细胞培养

采集NSCLC患者外周血50 ml，肝素抗凝，加等量的淋巴细胞分离液，将分离出的淋巴细胞种植于CD3-Ab和纤维连接蛋白包被的培养瓶中，加入IL-2等细胞因子，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后补充培养液及细胞因子，体外扩增约10~12天，当细胞培养结束，CIK细胞经微生物学检测阴性，离心去除培养液，0.9%氯化钠溶液洗涤3次，将细胞悬浮于20%的人血白蛋白及0.9%氯化钠溶液共200 ml的液体中经静脉回输患者体内，细胞量每次大于1×10¹⁰个，活力大于95%，1次/天，连输3天，为一个治疗周期。1.4 流式细胞仪检测NSCLC患者及健康对照组T细胞亚群的表达水平

分别于CIK细胞治疗前1天、第3次治疗后1月取患者外周血1 ml，并取1 ml健康者外周血作为对照组。将100 μl抗凝全血加入管底。同型对照管依次加入10 μl IgG1-ECD、20 μl IgG1-FITC、IgG1-PE荧光抗体，T细胞亚群管依次加入10 μl的CD3-ECD、20 μl的CD4-FITC和CD8-PE荧光抗体，Tregs管于破细胞膜处理后依次加入20 μl的CD4-FITC、CD25-PE和Foxp3-ECD荧光抗体。混匀后孵育30 min。每管内加入10×FACS溶解液2 ml，避光15 min，300 g离心5 min。弃上清液。每管加PBS将细胞重悬。流式细胞仪检测CIK细胞治疗前后CD3⁺T细胞、CD3⁺CD4⁺T细胞、CD3⁺CD8⁺T细胞、CD4⁺/CD8⁺T细胞比值、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞水平的变化以及与健康对照组相比T细胞亚群的差异。1.5 临床观察

参照《肺癌患者生活质量评估测量表》评价治疗前后患者一般情况的变化，挑选与治疗效果紧密相关且患者感到最为困扰的指标：失眠、饮食、体力、疼痛。1.6 统计学方法

所有计量资料用（x±s）表示，采用SPSS 21.0进行统计学分析，正态分布的两两比较采用t检验，率的比较采用χ²检验。P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 NSCLC患者CIK治疗前与健康对照组相比T细胞亚群的差异

本研究发现，CIK细胞治疗前与对照组相比，NSCLC患者外周血中CD3⁺ T细胞比例、CD3⁺CD4⁺ T细胞比例、CD4⁺/CD8⁺T细胞比值下降，差异均具有统计学意义（P<0.05）。CD3⁺CD8⁺ T细胞比例升高，差异具有统计学意义（P<0.05），见表 1。

表 1 CIK细胞治疗前后NSCLC患者T细胞亚群的变化 Table 1 Changes of T cell subsets in NSCLC patients before and after CIK cells therapy

表选项

3次CIK细胞治疗后与治疗前相比，NSCLC患者外周血中CD3⁺ T细胞比例、CD3⁺CD4⁺ T细胞比例、CD4⁺/CD8⁺T细胞比值升高，CD3⁺CD8⁺ T细 胞 比 例 降 低 ，且 差 异 均 具 有 统 计 学 意 义（P<0.05）。3次CIK细胞治疗后与对照组相比，CD3⁺ T细胞比例、CD4⁺/CD8⁺T细胞比值下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。CD3⁺CD4⁺ T细胞比例、CD3⁺CD8⁺ T细胞比例升高，但差异无统计学意义（P>0.05），见表 1。2.3 CIK细胞治疗对NSCLC患者体内Tregs细胞的影响

本研究中，CIK细胞治疗前NSCLC患者外周血中Tregs较对照组升高，Ⅲ~Ⅳ期患者较Ⅰ~Ⅱ期患者Tregs比例升高，且差异均具有统计学意义（P<0.05）。3次CIK细胞治疗后与治疗前相比，Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期患者Tregs比例下降，且差异均具有统计学意义（P<0.05）。3次CIK治疗后与对照组相比，Ⅰ~Ⅱ期患者Tregs比例低于对照组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。Ⅲ~Ⅳ期患者Tregs比例仍高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05），见图 1。

*: P<0.05 vs. Control group; △: P<0.05 vs. Before CIK cells therapy图 1 NSCLC患者治疗前与3次治疗后外周血Tregs的变化 Figure 1 Changes of Tregs in peripheral blood of NSCLC patients before and after three courses of CIK cells therapy

图选项

80例NSCLC患者中，3次CIK细胞治疗后，饮食情况较治疗前显著改善（P<0.05），体力情况较治疗前显著改善（P<0.05），疼痛情况及睡眠情况较治疗前有所改善，但差异无统计学意义（P>0.05）。治疗过程中有3例患者出现一过性发热，1例患者出现恶心，见表 2。

表 2 CIK治疗前后NSCLC患者一般情况的改变 Table 2 Changes of general condition of NSCLC patients before and after CIK cells therapy

表选项

机体正常免疫功能状态的维持，需要各种免疫细胞之间的相互协调及相互制约，以产生适度的免疫应答，既能有效的清除异物抗原，又不会对机体组织产生损伤。免疫功能低下或异常，不能有效的进行免疫防御反应，是肿瘤细胞免疫逃逸和术后复发的重要因素^[7]，抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，T细胞在细胞免疫中发挥主导作用。正常状态下，T细胞总数及各亚群处于相对的稳定状态，以发挥机体的免疫监视功能^[8]。当各亚群间比例失衡或数量异常时，可视为免疫调节功能异常，易发生肿瘤及自身免疫性疾病。

CD3⁺ T细胞代表机体总的T细胞数量，根据其表型不同分为CD3⁺CD4⁺ T细胞，CD3⁺CD8⁺ T细胞。CD3⁺CD4⁺ T细胞又称辅助性或诱导性T细胞，辅助和诱导其他免疫细胞发挥抗肿瘤活性。CD3⁺CD4⁺ T细胞对细胞毒性T淋巴细胞具有辅助和放大效应。此外，还可以分泌一些细胞因子参与机体的抗肿瘤免疫反应，如IL-2、TFN-γ、TNF-β等^[9]，在机体的免疫应答中处于中心地位。本研究中，CD3⁺CD8⁺ T细胞较治疗前降低，且差异具有统计学意义。CD3⁺CD8⁺ T细胞具有免疫抑制功能，可以抑制肿瘤的免疫应答活化阶段，其靶向细胞是辅助性T细胞和B细胞，从而抑制了细胞免疫及抗体的形成^{[10, 11]}。CD3⁺CD8⁺ T细胞包括细胞毒性T细胞和抑制性T细胞，CD3⁺CD8⁺ T细胞根据是否表达CD28，分为CD8⁺CD28⁺T细胞和CD8⁺CD28^-T细胞，前者具有细胞毒性功能，后者具有免疫抑制功能^{[11, 12]}。因此，CD3⁺CD8⁺ T细胞具有双向调节作用，两者之间的相互作用还有待进一步研究。CD4⁺/CD8⁺T细胞比值可以很好的反映宿主机体的免疫调节功能，该比值降低时提示患者的免疫功能降低。肿瘤浸润的淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）是肿瘤微环境中一类具有较强免疫活性的淋巴细胞，在抗肿瘤免疫反应中发挥了重要的作用^[13]。但由于其位于肿瘤微环境中，不利于进行动态观测，因此在临床上通常把外周血作为评估抗肿瘤免疫功能的样本。外周血CD3⁺ T细胞、CD3⁺CD4⁺ T细胞、CD3⁺CD8⁺ T细胞、CD4⁺/CD8⁺T细胞比值是反映机体免疫功能的重要指标，可代表机体的抗肿瘤免疫水平，肿瘤患者存在不同程度的免疫功能缺陷，检测外周血T淋巴细胞亚群的变化可评估机体免疫功能的变化并预测疾病的转归。本研究结果提示，NSCLC患者的外周血T细胞亚群状态及比例失衡、导致患者免疫功能紊乱、使患者存在免疫抑制和免疫逃逸。本研究中CIK细胞输注治疗可一定程度上改善NSCLC患者的免疫功能，增强机体的杀瘤活性，提高机体的免疫监视功能。

“免疫编辑学说”认为“免疫编辑”导致了肿瘤细胞的免疫逃逸^[14]。CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 调节性T细胞作为T细胞亚群的一种，在肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用。在肿瘤微环境中，免疫系统对肿瘤的免疫监视作用为发现并清除肿瘤细胞来维持机体肿瘤微环境的稳态。肿瘤微环境中的肿瘤细胞可通过分泌一些细胞因子对Tregs进行招募，一项研究工作已经鉴定出了一组细胞因子，可促进Tregs向肿瘤微环境中的迁移，有效的抑制抗肿瘤免疫反应，即胸腺和活化调节趋化因子、巨噬细胞源趋化蛋白，这两种细胞因子的受体均是Tregs表达的趋化因子受体CCR4^[15]。同时，Tregs还可分泌调节性细胞因子作用于肿瘤微环境，如Tregs分泌的可溶性非蛋白样因子与可溶性因子如吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）相互作用，抑制肿瘤微环境中T细胞的增殖，使肿瘤细胞逃避免疫攻击。肿瘤局部的Tregs还可以通过多种途径抑制其他免疫效应细胞的功能，如NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。本研究中，NSCLC患者与对照组相比，外周血Tregs比例升高，机体处于一种免疫抑制状态，且随着肿瘤的进展，该比例进一步升高，机体的免疫抑制逐渐加重，抗肿瘤免疫功能进一步减弱，这与Woo等^[16]研究结果一致，这提示我们机体的免疫功能状态与肿瘤的进展密切相关。3次CIK细胞治疗后，Tregs比例较CIK细胞治疗前均有所降低，且Ⅰ~Ⅱ期患者低于对照组，差异具有统计学意义，Ⅲ~Ⅳ期患者Tregs比例虽高于对照组，但差异无统计学意义。结果表明，CIK细胞输注治疗在不同分期的患者体内均能不同程度地改善免疫功能，一定程度上逆转由Tregs介导的免疫逃逸，改善患者的免疫功能。但也有研究表明，肿瘤患者体内的Tregs可抑制CIK细胞及其他免疫效应细胞的抗肿瘤活性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。同时，CIK细胞治疗也降低了患者外周血Tregs的数量，它们之间的相互作用还有待进一步研究^[17]。Treg、TGF-10和IL-10在肿瘤微环境中相互影响和作用，诱导了肿瘤的免疫耐受。而寻找消除这些免疫抑制因素的新方法，成为肿瘤免疫治疗领域研究的重要课题^[18]。

标准的传统放化疗，因其严重的不良反应及其他诸多方面的因素，导致患者生活质量下降或被迫停药。本研究显示，在CIK细胞治疗过程中，仅有3例患者出现一过性发热，1例患者出现轻微的恶心症状，给予对症处理后，患者症状缓解。且患者的一般情况如饮食、体力情况较治疗前均显著改善。因此，过继性免疫细胞输注治疗有别于传统的治疗模式，改善患者一般情况且无明显不良反应，相对安全有效。

综上所述，NSCLC患者体内免疫功能紊乱，免疫抑制细胞比例升高，免疫杀伤细胞比例降低，且晚期患者体内的免疫抑制状态更为显著。CIK细胞治疗可提高NSCLC患者T细胞的杀伤功能，同时对Tregs介导的免疫抑制及免疫逃逸具有一定的逆转作用，可一定程度上改善患者的一般情况，提高患者生活质量，未见明显不良反应。过继性免疫细胞输注治疗可一定程度上改善患者的抗肿瘤免疫功能，有望大规模应用于临床。