食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球年新发病约为48.2万例，年死亡约40.7万例，中国食管癌粗发病率和粗死亡率均居世界第1位，在我国恶性肿瘤中，食管癌发病率居第4位、死亡率居第5位^{[1, 2]}。我国食管癌一直以食管鳞癌为主，食管腺癌的发病率未见明显的增长^[3]。在治疗方面，早中期食管癌普遍采用手术或放疗为主、化疗为辅的治疗模式，晚期则采用放、化疗联合治疗模式。目前药物治疗仍是晚期食管癌治疗的重要手段之一，但总的疗效并不令人满意^[4]。

食管癌的靶向治疗是当前研究热点，索拉非尼（sorafenib）作为一种小分子多激酶抑制剂，能有效抑制Raft丝裂原活化的细胞外信号调节激酶的激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路^[5]。2005年，sorafenib被美国食品和药品管理局（FDA）批准用于治疗晚期肾细胞癌。2007年，美国临床肿瘤学会年会公布的研究结果显示，sorafenib可有效延长晚期肝细胞癌患者的生存时间^[6]。临床前及临床研究显示，索拉非尼具有明显的抗肿瘤效应，Ⅰ、Ⅱ期临床试验发现索拉非尼在肺癌、恶性黑色素瘤等肿瘤中具有抗肿瘤效应^{[7, 8]}。目前，关于sorafenib对食管癌作用尚未报道，本研究旨在初步探讨sorafenib对人食管鳞癌EC9706细胞株的生长抑制作用及其机制。1 材料与方法1.1 材料

人食管鳞癌EC9706细胞由郑州大学基础医学院重点实验室馈赠。索拉非尼购自德国Bayer公司，RPMI 1640培养液、2.5 g/L胰蛋白酶均购自北京Solarbio公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，二甲基亚砜、Hoechst/PI 双染试剂盒购自南京凯基生物公司，反转录试剂盒购自上海诺论生物公司，引物购自上海生工生物工程有限公司，抗体购自美国Santa Cruz公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养

常规培养EC9706细胞，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（内含青霉素100 ku/L、 链霉素100 mg/L）于37℃ CO₂培养箱中培养，用0.25%胰酶消化传代，每2天换液传代1次。1.2.2 细胞划痕实验

取对数生长期细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，细胞密度为5×10⁵个/孔，接种于6孔板中，培养24 h贴壁后，用10 μl标准无菌枪头垂直于6孔板底面划痕，以sorafenib终浓度3、6 μmol/L加药分组，对照组不加药，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，作用24 h后于倒置显微镜下观察药物作用后细胞形态变化、取样，拍照，测量细胞向划痕区迁移的相对距离，实验重复5次。 1.2.3 Hoechst/PI凋亡检测

实验组按sorafenib终浓度3、6 μmol/L加药分组，对照组不加药。细胞培养48 h后，吸除培养液，胰蛋白酶消化，悬液转移至离心管离心后，去上清液，经吹打、收集、离心，PBS洗后，将1×10⁶个细胞悬浮于1 ml培养液，加入10 μl Hoechst染液混匀，37℃孵育10 min后，4℃离心5 min后去上清液，用1 ml Buffer A重悬细胞，加5 μl PI染液后室温暗室孵育15 min。荧光显微镜观察细胞形态变化、取样、拍照，实验重复3次。 1.2.4 q RT- PCR检测5种基因mRNA的表达水平

实时荧光定量PCR：实验组按6 μmol/L加药，对照组不加药。细胞培养48 h后，收集细胞，按 Trizol试剂盒说明提取总RNA，电泳鉴定、定量，反转录合成cDNA。PCR反应前3~15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调节基线至适宜处，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为Ct值。根据公式ΔCt=Ct_目的基因－Ct_β-actin和ΔΔCt=2^－ΔΔCt，计算检测基因mRNA相对表达量，每组重复3次并取平均值。所检测目的基因AKT、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、TIMP1和β-actin的相关PCR引物序列，见表 1。

表 1 qRT-PCR检测所需的引物序列Table 1 Primer sequences required for qRT-PCR

表选项

实验组按6 μmol/L加药，对照组不加药。细胞培养48 h后，用预冷的PBS冲洗3次后，冰上裂解15 min，4℃、13 000 g 离心30 min；将上清液转移至1.5 ml离心管，加入5×SDS smple buffer混匀，蛋白变性，分装，置于-80℃保存。测定样品蛋白浓度：将蛋白样品加入10% SDS-聚丙烯凝胶中电泳分离，电泳完毕后，切胶，冰上转膜；经5%脱脂奶粉封闭，分别加入AKT（1:1 000），p-AKT（1:1 000），Bcl-2（1:1 000），MMP-2（1:300），TIMPl（1:300），β-actin（1:1 000）后4℃孵育过夜，再加入二抗（1:5 000）后常温孵育1 h，最后暗室曝光，拍照。1.3 统计学方法

　采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。各实验至少重复3次，数据资料用x±s表示，两样本采用t检验，经方差齐性检验，多组均数比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 sorafenib对EC9706细胞迁移的影响

通过细胞划痕实验发现，培养24 h后，对照组细胞迁移入划痕区的相对距离较3 μmol/L组和6 μmol/L组细胞明显减少12.5 μm和15.4 μm，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图 1。

A-C: effects of sorafenib on the migration of EC9706 cells detected by cell wound healing assay; A: control group;B: 3μmol/L group; C: 6μmol/L group; D: relative average distance of cell migration after cultured for 24 hours detected by cell wound healing assay; *: P＜0.05, compared with the control group图 1 划痕实验检测sorafenib对EC9706细胞迁移的作用（×100）Figure 1 Effect of sorafenib on the migration of EC9706 cells detected by cell wound healing assay(×100)

图选项

sorafenib作用EC9706细胞48 h后，同对照组相比，实验组（3 μmol/L组和6 μmol/L组）红染细胞增多，且随着药物浓度的增加，凋亡细胞明显增加（P＜0.05），见图 2。

A: control group; B: 3μmol/L sorafenib group; C: 6μmol/L sorafenib group图 2 Hoechst/PI 染色阳性细胞（×100）Figure 2 Positive staining cells detected by Hoechst/PI(×100)

图选项

结果显示，与对照组相比，加药组（6 μmol/L组）AKT、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达下调，TIMP1表达上调，见表 2。

表 2 Sorafenib对EC9706细胞5种基因mRNA表达水平的影响（n=5）Table 2 Effect of sorafenib on the expression of five gene mRNAs in EC9706 cells (n=5)

表选项

同对照组相比，6 μmol/L组sorafenib能够明显降低AKT、p-AKT、MMP-2、Bcl-2蛋白的表达水平，提高TIMP1蛋白表达水平，见图 3A、3B。

1: control group; 2: drug group 图 3 sorafenib对EC9706细胞5种蛋白水平表达的影响（n=5）Figure 3 Effect of sorafenib on the expression of five proteins in EC9706 cells (n=5)

图选项

已有研究报道 ，单靶点EGFR TKI如gefitinib、erlotinib用于二线治疗晚期食管癌，效果不够理想^{[9, 10]}。食管癌发病机制复杂，当抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）旁路时，能够使绝大多数肿瘤临床症状明显改善^[11]。因此多靶点可能比单靶点治疗食管癌更有效。

sorafenib作为一种小分子多激酶抑制剂，它不仅能够有效抑制丝氨酸激酶、苏氨酸激酶的活性，还可以抑制血管内皮生长因子受体，血小板衍生生长因子受体以及c-Kit、Flt-3、RET等受体，从而抑制多条下游信号通路的激活^[12]。血管内皮生长因子（VEGF）和金属基质蛋白酶（MMPs）相互影响、相互作用，能够共同促进肿瘤细胞浸润及转移^[13]。基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）是MMPs的特异性组织抑制物，TIMP-1低浓度表达与肿瘤的远处转移相关^[14]。PI3K-AKT信号通路在肿瘤发生、发展中起着重要作用，当其发生突变时，调控基因表达，从而诱导肿瘤的生成^[15]。Bcl-2 蛋白是一种能够抑制细胞凋亡的抗凋亡蛋白，该蛋白表达上调与不良预后有着直接关联，表达下调能够增强肿瘤对凋亡的敏感度。有研究表明，PI3K-AKT信号通路可以通过上调基质金属蛋白酶（MMP）的表达促进肿瘤血管生成等途径增强肿瘤细胞的侵袭^[16]。sorafenib由于能够抑制血管内皮生长因子受体的表达，进而阻断 PI3KAKT通路，显示出抗肿瘤活性。

在本实验中，s o r af en ib能够抑制食管鳞癌EC9706细胞的迁移，促进其坏死凋亡，同时降低MMP-2、MMP-9、AKT、p-AKT、Bcl-2的表达水平，上调TIMP1表达水平，提示sorafenib可能是通过抑制VEGF来抑制PI3K-AKT信号通路而下调 Bcl-2及MPPs的表达，这些方式可能是其抗肿瘤的机制之一。由于sorafenib为多靶点的抗肿瘤药物，其抗肿瘤机制复杂，仍需今后进一步研究与探讨。