胸腔积液的病因复杂，包括恶性肿瘤、肺 炎、结核感染、免疫系统疾病、肺栓塞、心衰、 肝肾疾病等^[1,2]。在我国，渗出性胸腔积液中，恶 性肿瘤引起的胸腔积液仅次于结核性胸腔积液位 居第二^[3]。当前，由于受到敏感度和特异性的制 约，通过现有手段诊断恶性胸水的假阴性率可高 达31.5%，这直接影响到患者疾病状态的评估、治 疗方案的选择及预后的判断。所以探寻高特异性 及敏感度的新生物标志物意义重大。

蛋白质组学是后基因组研究时代的重要内容^[4]， 现如今蛋白质组学已广泛应用于血液、胸腔积液等 各种体液的研究，为筛选疾病相关标志物提供了新 的契机。

本文主要归纳了近年来应用蛋白质组学发现 恶性胸腔积液中生物标志物的研究，主要从蛋白 质组学的两大前沿研究内容——组成蛋白质组学 和比较蛋白质组学两方面展开综述。 1 组成蛋白质组学发现恶性胸腔积液的生物标志物

组成蛋白质组学，即主要对某个体系中的所 有蛋白质进行定性或定量研究，详细阐述其翻译 后修饰的特征^[5,6,7]。

恶性胸腔积液中含大量的蛋白质，其中不乏 组织特异性、疾病相关性蛋白质，或可筛选成为 生物标志物。查阅近年来文献，归纳恶性胸腔积 液蛋白质主要有：血浆蛋白、细胞分泌蛋白、外 泌体的膜蛋白、细胞外基质结构及其分解产物、 坏死细胞的细胞质蛋白^[8,9,10]。这些蛋白的研究在完 善恶性胸腔积液蛋白数据库、探索恶性肿瘤生物 标志物、寻求新的抗肿瘤治疗方法等方面具有重 要意义。 1.1 胸腔积液中外泌体的研究

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系 列调控过程而形成的细胞外纳米级的小囊泡，可 由定向造血干细胞、上皮细胞、免疫细胞或肿瘤 等细胞分泌，是胸腔积液蛋白成分之一，由肿瘤 细胞分泌的外泌体与肿瘤演进有关，可以促进血 管新生、肿瘤转移等多个环节，还含有特异性抗 原、调节免疫功能，提示可能在肿瘤免疫治疗中 发挥作用^[11]。

近期一项有关外泌体的研究中，Bard等^[8]证 明了恶性胸腔积液中存在外泌体，并鉴定了其蛋 白组成。研究者在9例胸腔积液中（4例恶性胸膜 间皮瘤、2例肺癌、2例乳腺癌、1例卵巢癌）成 功用蔗糖梯度超离心法及电镜提纯且检测到了胸 腔积液中的外泌体，之后采用SDS-PAGE分离， MALDI-TOF和Western blot方法鉴定了这些蛋白 质。不仅验证了之前Andre等发现的热休克蛋白、 MHC等蛋白^[12]，还首次证明了SNX25、BTG1、 PEDF、凝血酶敏感蛋白2、基膜硫酸软骨素也是外 泌体中存在的蛋白，此外还存在一些参与渗出液 强烈免疫反应的蛋白，这些蛋白与肿瘤演进和免 疫反应有关，尤其是后者有希望用于肿瘤的免疫 治疗。

以上研究的恶性胸腔积液来自不同肿瘤，Park 等^[13]又将研究对象局限于非小细胞肺癌患者的胸 腔积液，对3例非小细胞肺癌患者的胸腔积液中高 纯度的外泌体（40~150 nm）进行研究，采用一维 SDS-PAGE分离及液相色谱串联质谱进行分离鉴 定，鉴定出912个具有高置信度的外泌体蛋白，其 中含23.4%的细胞膜成分，13.4%的细胞质蛋白， 10.7%的MHC蛋白复合体，5.9%的其他蛋白质复 合体等。用生物信息学手段鉴定及筛选了病理相 关蛋白及NSCLC潜在的生物标志物，其中包括肺 富集表面抗原和EGFR信号通路相关的蛋白，这为 外泌体在肿瘤演进方面的研究提供了新视角，可 能成为NSCLC新的诊断工具。 1.2 胸腔积液中血浆蛋白及胸水特异性蛋白的研究

胸腔积液中含有由血浆滤过的蛋白质，其成 分与血浆相似，但同时，由于胸腔积液局限于胸 腔中，故其又有自身疾病的特点，含有组织特异 性的蛋白。

Pernemalm等^[14]证明了胸腔积液中不仅存在血 浆蛋白，同时也存在其特异性蛋白。研究者采用 窄谱等点聚焦电泳（IEF），分析了3例肺腺癌的 恶性胸水和血浆的蛋白谱，证明了两者蛋白有高 度的（60%~70%，189个）重合，同时也有一部 分蛋白（111个）存在于恶性胸水中而在血浆中缺 如，其中60%为胞内蛋白，这说明胸水中含有丰富 的肺组织相关蛋白。最后，研究者用Western blot 方法鉴定了其中的9个蛋白，其中NPC2在肺腺癌 胸水中显著表达，这个蛋白很可能由肿瘤细胞分 泌，肯定了蛋白质组学方法在发现胸腔积液生物 标志物的作用。

以上研究采用基于凝胶电泳-质谱技术（2-DEMS） 的经典蛋白质组学研究，其具有一定局限性^[15,16]： 如操作费时、费力，难以对大分子量及低丰度的蛋白 进行鉴定。

下面的研究采用更为快速、高效、灵敏度高 的方法：基于液相色谱-串联质谱的（2D LC-MS/ MS）的鸟枪法蛋白质组学研究证明胸腔积液中蛋 白质与血浆蛋白成分相似，且恶性胸腔积液中还 含有特异性的蛋白。Tyan等^[17]用该方法分析了43 例肺腺癌胸腔积液的蛋白谱，结果发现了1 415个 胸腔积液蛋白质，其中124个有较高置信度。证明 有69个蛋白为来自于血浆的蛋白，其余的蛋白很 有可能特异的表达于胸腔积液中。Tyan等^[18]为进 一步筛选生物标志物又进行了研究，用二维凝胶 电泳分析了7例肺腺癌患者的恶性胸腔积液，最终 鉴定出44个较高置信度的蛋白。其中，有7个蛋白 尚未在血浆中发现，这些蛋白是：视网膜母细胞 瘤结合蛋白7、突触囊泡膜蛋白、皮质类固醇结合 球蛋白前体、锌指蛋白域包含的蛋白11、包膜糖 蛋白、MSIP043和肌联蛋白。视网膜母细胞瘤结合 蛋白7在调节细胞分裂、分化等方面发挥作用，具 有很大研究价值。这些蛋白特异性存在于胸腔积 液中，很有可能来自于实质器官腔隙，可作为诊 断恶性胸腔积液的候选生物标志物。

同样采用鸟枪法，Sheng等^[19]也证明了这点， 其选取5例肺腺癌的恶性胸腔积液，最终生成123 个有较高置信度蛋白，这些蛋白质大部分都与 血浆蛋白质重叠，仅有7个特异表达于恶性胸腔 积液，它们是：JUP蛋白、膜联蛋白A2、转化生 长因子βig-h3蛋白、V-set及免疫球蛋白区域包含 蛋白4、Ifapsoriasin2、肌动蛋白胞质型1(Actin, cytoplasmic 1)和Suprabasin，它们极有可能成为诊 断肺腺癌的分子标志物，其中膜联蛋白A2因其具 有调节细胞的黏附和生长增殖能力而更具特殊意 义，这项研究对补充恶性胸腔积液蛋白谱及筛选 肺腺癌候选生物标志物具有重要意义。 1.3 胸腔积液中肿瘤分泌蛋白的研究

胸腔积液中还含有肿瘤细胞分泌的蛋白，这 些蛋白具有肿瘤的特异性，可以作为候选的肿瘤 标志物。

为了证明蛋白由肿瘤细胞分泌，下面两项研 究采用细胞系分泌蛋白同胸水分泌蛋白谱进行阳 性对照。Wang等^[20]同时对2条细胞系分泌蛋白和 胸水的蛋白谱进行研究，发现有22个两者共同存 在的蛋白，除去已知血浆蛋白和已知肺癌标志物 后，选择RbAp46蛋白进行更进一步的研究，证明 RbAp46 mRNA和RbAp46蛋白在肺癌组织中表达 上调，与癌细胞的迁移有关，其有可能成为新的 肺癌标志物和预后指标。

采用同样的策略，Yu等^[10]分析了13例恶性胸 水的蛋白质，在除去高丰度蛋白后，采用SDSPAGE 法分离蛋白质，液相色谱串联质谱鉴定 蛋白，生成了482个恶性胸水的非冗余蛋白，并 与3个腺癌细胞系的分泌蛋白作比较，来找到来 源于肿瘤细胞分泌的生物标志物。通过ELISA 鉴定，4个蛋白可作为候选者：α-2-HS-糖蛋白 （AHSG）、血管生成素、半胱氨酸蛋白酶抑制 剂-C和胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP2）。 通过68例恶性胸水和119例良性胸水验证，发现 AHSG和IGFBP2在恶性胸水中的表达明显较高， 且IGFBP2与肺癌细胞的迁移有关。这项研究肯定 了蛋白组学在筛选生物标志物中的重要作用，同 时证明了胸腔积液中存在肿瘤细胞分泌的蛋白。 2 比较蛋白质组学探索恶性胸腔积液中的生物标 志物

比较蛋白质组学，即比较不同蛋白质组差异 与相似性，从而发现疾病可能的病因^[5,6,7]，找出疾 病相关生物标志物。归纳近年研究文献，恶性胸 腔积液的比较蛋白质组学研究主要应用于筛选肺 癌及恶性胸膜间皮瘤相关的生物标志物。 2.1 筛选肺癌相关生物标志物

在鉴别良恶性胸腔积液，发现肺癌生物标志 物的研究中，Rodríguez-Piñeiro等^[21]用NSCLC患 者的胸腔积液同肺部良性疾病的胸腔积液（各4 例）进行对比。采用双向荧光差异凝胶电泳来比 较两者蛋白组差异，最后证明金属蛋白抑制剂2、 钙结合微丝蛋白、血管生成相关的色素上皮衍生 因子（PEDF）在恶性胸水中高表达，S100-A8和 S100-A9在恶性胸水中低表达。该研究用免疫检测 法证明了超过12种PEDF的亚型均在NSCLC患者 胸腔积液中高表达。而Hsieh等^[22]之前进行的一项 恶性胸腔积液（14例）同漏出液（13例）的比较 蛋白组学研究证明：色素上皮衍生因子在恶性胸 腔积液中要显著低于漏出性胸腔积液。这可能因 为Hsieh等的研究对象是蛋白差异较大的漏出液和 恶性胸腔积液有关，还可能由于两研究检测到的 PEDF异构体不同有关。因此进一步研究PEDF的 异构体与肿瘤病因的关系很有必要。

随后，Wang等^[23]用二维凝胶电泳的方法对比 了良性胸腔积液（肺炎及结核）与肺腺癌恶性胸 腔积液（各10例），用MALDI-TOF质谱法鉴定了 其中16个差异蛋白，筛选出5个蛋白质：血液结合 素、TTR和fibrinogen蛋白在恶性胸水、血清、组 织中均上调；SAP在恶性胸腔积液中显著下调，但 在血清中无差异；JMJD5在恶性胸腔积液、肿瘤 组织中均下调。提示这些蛋白可能成为肺癌生物 标志物，可以作为血浆或其他常规临床检验的补 充诊断，用于良恶性胸腔积液的鉴别。

此外，还有一些研究通过对比良恶性胸腔积液 中某些已知的肿瘤相关蛋白水平，揭示了其鉴别 诊断的能力，提示其可能作为鉴别诊断的生物标 志物。Wang等^[24]发现恶性胸腔积液的apoE明显高 于良性胸腔积液，且腺癌胸腔积液的apoE明显高于 其他病理类型的肺癌，该研究提示apoE有希望作为 恶性胸腔积液的候选生物标志物。Wu^[25]、Görgün^[26] 等发现了恶性胸水中生存素高于良性，鉴别两者 的敏感度较高(两项研究分别为85%，72%)，因 其不具有鉴别结核与肿瘤的能力，故特异性较低 （两项研究分别为75%，44%），且生存素水平 越高预后越差，这说明生存素可能是肺癌诊断及 预后的标志物。Xu等^[27]发现SiSo细胞受体结合肿 瘤抗原sRCAS1在恶性胸腔积液中表达明显高于良 性，其在鉴别良恶性胸腔积液中有一定价值。 2.2 筛选恶性胸膜间皮瘤相关生物标志物

恶性胸膜间皮瘤常常伴有大量胸腔积液，与 腺癌侵犯胸膜在临床上往往难以区分。近年利用 比较蛋白质组学对两者的鉴别方法层出不穷，其 中较有价值的是Pass等^[28]通过比较发现胸膜相关 肽段（SMRP）在恶性胸膜间皮瘤胸腔积液中高表 达，提示胸腔积液中的SMRP有望成为恶性胸膜 间皮瘤相关生物标志物。此外，Hirayama等^[29]通 过比较发现恶性胸膜间皮瘤胸水中VEGF水平明显 较非胸膜间皮瘤高，且与患者生存时间有关，提 示VEGF可能是恶性胸膜间皮瘤诊断及预后的标志 物。Amany等^[30]对比发现间皮素和骨桥蛋白可以 作为诊断恶性胸膜间皮瘤的标志物，且对胸膜固 定术的患者具有预后意义。 3 小结

组成蛋白质组学在胸腔积液中的应用，使人 们对胸腔积液的蛋白谱的认识渐渐明了，对阐 明发病机制有重要意义；比较蛋白质组学在胸腔 积液中的应用对比了不同病因的胸腔积液蛋白的 差异，对找出疾病特异性的生物标志物意义重大 （生物标志物归纳见表 1）。今后蛋白质组学对胸 腔积液的研究依然是热点，目前研究尚存在以下 问题：胸水蛋白谱需进一步完善，在胸腔积液中 发现药物靶点的研究尚未报道，新发现的血清标 志物也急需在胸水中得到验证，这为今后的工作 指明了新的研究方向。随着研究深入及技术的完 善，蛋白质组学筛选胸腔积液中的生物标志物有 着广阔的发展前景，其筛选出的生物标志物应用 于临床更加指日可待。

表 1 胸腔积液中重要的候选生物标志物 Table 1 Important potential candidates of biomarker in MPE

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