胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，尽管经手 术、放疗及化疗等综合治疗，患者总体预后仍较 差^[1]。近10余年研究进展发现，胶质瘤内的胶质瘤 干细胞为放、化疗抵抗及肿瘤复发的根源，因此 诱导该类原始细胞分化，增强其对术后辅助治疗 的敏感度，为一重要的研究策略^[2]。

在众多的促分化药物中，维甲酸因较显著地 促白血病干细胞的分化效应在胶质瘤的研究中受 到了关注。维甲酸促分化治疗已开始用于脑胶质 瘤的Ⅱ期临床研究，但疗效欠佳，提示胶质瘤细 胞可能对维甲酸诱导分化存在着抵抗^[3]。可能抵 抗机制众多，而维甲酸在肿瘤细胞内的代谢、转运异常可作为一重要的研究切入点^[4]。在乳腺 癌中的研究表明维甲酸可与细胞质内维甲酸结 合蛋白2（cellular retinoic acid-binding protein 2， CRABP2）结合，发挥促细胞分化或凋亡效应，或 与脂肪酸结合蛋白5（fatty acid-binding protein 5， FABP5）结合，发挥促增殖效应^[4]。FABP5的异常 高表达、CRABP2的异常低表达导致维甲酸促增殖 效应的发挥，可为肿瘤对维甲酸抵抗机制之一^[4]。 因此，我们推测胶质瘤细胞质内维甲酸转运蛋白 FABP5和CRABP2的表达可能存在异常，基于此我 们进行了上述两分子在脑胶质瘤中的表达研究。 1 材料和方法 1.1 材料

收集2011年9月—2012年9月期间华中科技大学 同济医学院附属同济医院神经外科行手术治疗并经 病理证实的脑胶质瘤标本，共125例，其中男70例、 女55例；年龄15~77岁，平均年龄（45±28）岁； 按 WHO病理分级为：Ⅱ级25例、Ⅲ级34例、Ⅳ级66例。 胶质瘤细胞株NCH82、NCH87及NCH89由德国海德 堡大学神经外科研究室Herold-Mende教授惠赠。 1.2 试剂

鼠抗人FABP5单克隆抗体（稀释度1:50） 及鼠抗人CRABP2单克隆抗体（稀释度1:50） 均购自英国Abcam公司；生物素化羊抗鼠二抗 （1:200）、ABC法试剂盒及AEC显色试剂盒均购 自美国Vector Laboratories公司。RNA提取试剂盒 RNEasy Mini Kit购自德国Qiagen公司。荧光定量 ABsolute^TM QPCR Capillary Mix Kit试剂盒购自美 国Thermo scientific公司。FABP5、CRABP2及内参 PitPNB实时定量PCR引物设计采用Universal probe finder网络软件，引物均由德国Tibmol公司合成。 Brdu-ELISA试剂盒购自德国Roche公司。全反式 维甲酸（all trans retinoic acid,ATRA）购自美国 Sigma-Aldrich公司。 1.3 免疫组织化学染色法

采用ABC法。石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙 醇水化，磷酸盐缓冲液（PBS）洗5 min，以pH 9.9枸 椽酸盐抗原修复液，94℃孵育20 min行抗原修复。 PBS洗涤3次，每次5 min，再滴加FABP5或CRABP2 一抗，4℃过夜孵育。PBS洗涤3次，每次5 min后， 以生物素化抗鼠二抗室温下孵育30 min。继以PBS 洗涤3次，每次5 min，加ABC复合物室温作用30 min。PBS洗涤3次，每次5 min后，加AEC显色5~30 min，显微镜下依据显色强度，适时在PBS中终止显 色反应，苏木精对比染色，自来水冲洗，封片。 1.4 免疫组织化学结果评判

在200倍视野下观察，随机选取4个视野，拍 照。每视野行阳性细胞计数，并计算百分比， 取平均值作为该样本的阳性细胞表达比例。同 时采用华中科技大学同济医学院病理教研室 HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统进行 图像分析，测量FABP5及CRABP2表达的吸光度 值，取平均值作为其表达强度。平均吸光度值≥ 0.04为阳性表达。 1.5 细胞培养

阳性细胞组为ATRA处理组，阴性对照组为无 ATRA处理组。阴性组胶质瘤细胞培养于添加10% 胎牛血清的DMEM培养液中，阳性组细胞培养于 含1 μmol/L ATRA的上述培养液中，ATRA作用时 间为1周。培养箱环境为37℃、含5% CO₂和20% O₂，每3天换液1次。 1.6 Brdu-ELISA细胞增殖测定

胶质瘤细胞以每孔5×10³的密度接种于96孔板， 孵育48 h后，每孔加入10 μmol/L的Brdu标记液， 37℃孵育24 h后，按说明书步骤完成Brdu测定。 1.7 实时荧光定量PCR

胶质瘤细胞的RNA提取采用RNEasy MiniKit试剂盒并按说明书指导步骤进行。 cDNA的合成及PCR反应液的配制采用 ABsolute^TM QPCR Capillary Mix Kit试剂盒，依 据厂家指导步骤进行。FABP5上游引物序列： 5’-GCAGACCCCTCTCTGCAC-3’；下游引物 序列：5’-TCGCAAAGCTATTCCCACTC-3’。 CRABP2上游引物序列：5’-CGAGGAATTGCTCA AAGTGC-3’；下游引物序列：5’-TCCTGTTTGAT CTCCACTGCT-3’。PitPNB上游引物序列：5’-CGA GACTCAGAAAGAACTAGAAACAA-3’；下游引 物序列：5’-TGACCCTACAGGGGACTCAT-3’。反 应条件为：95℃ 15 min； 95℃ 15 s，59℃ 1 min， 72℃ 1 s，循环40次；40℃ 30 s。管家基因PitPNB 作为内参，FABP5 mRNA及CRABP2 mRNA定量结 果采用RelQuant 1.01软件分析得出。 1.8 统计学方法

计量资料以x ±s表示，各组间均数比较以Excel软 件t检验进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 FABP5蛋白表达与胶质瘤患者病理级别的关系

免疫组织化学染色显示脑胶质瘤样本中FABP5 阳性染色主要定位于细胞质，见图 1。FABP5 蛋白表达随胶质瘤病理级别的升高而显著增加 （P<0.05）：在WHOⅡ级星型细胞瘤中阳性细胞 比例为（16±9）% ，平均表达强度为（0.0686± 0.03）； WHOⅢ级肿瘤中占（33±22）%，平均表 达强度为（0.0948±0.0476）；在WHOⅣ级肿瘤中占（50±29）%，平均表达强度为（0.1541±0.044）。

A :WHO gradeⅡ glioma; B: WHO grade Ⅲ glioma; C: WHO grade Ⅳ glioma 图 1 FABP5蛋白在脑胶质瘤中的表达 (ABC ×200) Figure 1 Expression of FABP5 proteins in gliomas (ABC ×200)

图选项

免疫组织化学染色显示脑胶质瘤样本中 CRABP2阳性染色主要定位于细胞质，见图 2。 CRABP2表达随胶质瘤病理级别的升高而显著减少 （P<0.05）：在Ⅱ级星型细胞瘤中阳性细胞比例为 （46±12）%，平均表达强度为（0.210±0.056）；Ⅲ 级肿瘤中占（30±15）%，平均表达强度为（0.160± 0.064）；在Ⅳ级肿瘤中占（10±9）%，平均表达强 度为（0.080±0.055）。

A :WHO grade Ⅱ glioma; B: WHO grade Ⅲ glioma; C: WHO grade Ⅳ glioma 图 2 CRABP2蛋白在脑胶质瘤中的表达 (ABC×200) Figure 2 Expression of CRABP2 proteins in gliomas (ABC×200)

图选项

用Brdu-ELISA法检测并比较了ATRA对胶质瘤 细胞株NCH82、NCH87及NCH89作用前后的细胞 增殖状况，结果显示ATRA作用后，细胞增殖显著 增加（P<0.05），见图 3。

*:P<0.05,compared with the data before ATRA treatment 图 3 ATRA对胶质瘤细胞株的增殖效应检测 Figure 3 Proliferative effect of ATRA on glioma cell lines

图选项

以实时荧光定量PCR检测ATRA作用前后胶 质瘤细胞株NCH82、NCH87及NCH89中FABP5及 CRABP2在mRNA水平的表达，显示ATRA作用 后FABP5表达显著上调（P<0.05），见图 4A，而 CRABP2显著下调（P<0.05），见图 4B。

A: FABP5; B: CRABP2 *: P<0.05,compared with the data ATRA treatment 图 4 ATRA作用前后胶质瘤细胞株中FABP5及CRABP2在mRNA水平的表达 Figure 4 Expression of FABP5 and CRABP2 mRNA in glioma cell lines before and after ATRA treatment

图选项

本研究表明在脑胶质瘤中FABP5蛋白表达与 胶质瘤恶性级别呈显著正相关，FABP5可能与脑胶 质瘤的恶性进展相关。FABP5属于脂质结合蛋白超 家族的一员，主要参于细胞脂肪酸的代谢、转运， 并可与细胞内维甲酸结合，将其转运至PPARβ/δ信 号通路，从而发挥促细胞增殖功能^[4]。已有研究表 明，FABP5促增殖效应参与了许多人类肿瘤的发生 及发展。例如，在胆管癌细胞的研究中，FABP5沉 默后，细胞增殖明显降低，而过表达后，细胞增殖 及侵袭能力明显增高；在临床样本中，FABP5蛋白 表达与肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵袭及病变分 期呈显著正相关^[5]。在雌激素阴性表达的乳腺癌细 胞中，FABP5敲除后，细胞增殖降低；在乳腺癌组 织中，FABP5蛋白表达与肿瘤级别及患者预后显著 相关^[6]。因此，FABP5在脑胶质瘤中的效应与在其 他人类肿瘤中的效应体现了一致性。

CRABP2蛋白也为细胞内维甲酸的结合转运 蛋白，但其负责将维甲酸转运至维甲酸受体信号 通路，继而发挥了促细胞分化及凋亡功能^[4]。有关 CRABP2蛋白与人类肿瘤之间关系的报道较少。本 研究表明，在脑胶质瘤中，CRABP2蛋白表达与胶 质瘤恶性级别呈显著负相关，提示CRABP2扮演了抑癌基因的角色。

生理状况下，细胞通过调控FABP5/CRABP2 表达比例，对机体内源性维甲酸的促分化或促增 殖效应进行调节，继而保持了自身稳态。而病理 状况下，上述比例失控，如肿瘤细胞中FABP5过 度高表达，而CRABP2过度低表达，则造成了维 甲酸被竞争性的转运至PPARβ/δ，导致促增殖通路 持续活化，肿瘤细胞异常增殖，促进肿瘤发生发 展；同时，因维甲酸受体促分化通路持续失活，肿 瘤细胞表现出对维甲酸分化的抵抗效应^[4]。例如， Schug等^[7]在维甲酸抵抗的鼠乳癌模型中观察到 FABP5/CRABP2表达比例高于正常，维甲酸发挥 了明显的促增殖效应，但将上述比例逆转后，维 甲酸则表现出促分化的抗癌效应。Gupta等^[8]在胰 腺癌中依据FABP5/CRABP2表达比例的不同，同 样发现了维甲酸的截然相反效应。本研究在脑胶 质瘤标本中发现FABP5及CRABP2蛋白表达随胶质 瘤级别呈截然相反的变化，在WHO Ⅳ级胶质母细 胞瘤中，FABP5/CRABP2比例可达最高。进一步 在培养的胶质瘤细胞中显示维甲酸处理组相对于 未处理组，细胞增殖明显增强，FABP5表达显著上 调，而CRABP2显著下调，因此维甲酸作用后胶质 瘤细胞中FABP5/CRABP2比例显著增高，提示维 甲酸可能被竞争性转运至FABP5-PPARβ/δ 增殖通 路，发挥了促增殖效应，与此同时，胶质瘤细胞 体现了对维甲酸的分化抵抗效应。

在已报道的部分实验研究中证实了维甲酸对胶 质瘤细胞显著的促分化、凋亡效应^{[9, 10]}，而本研究 观察到与上述研究不一致的维甲酸效应，该差异 可归因于胶质瘤为一显著的异质性群体。不同个 体的胶质瘤细胞可在其基因表达、调控、细胞构 成以及对辅助治疗的敏感度上存在区别^[11]。例如并 非所有的胶质瘤细胞对化疗药物替莫唑胺敏感， 其中表达DNA修复蛋白O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转 移酶 （O6-methylguanine-DNA methyltransferase， MGMT）的胶质瘤细胞体现了明显的耐药性，同 理，也并非所有的胶质瘤细胞可体现敏感的维甲 酸治疗效应。基于本研究结果，未来可构想，依据 肿瘤组织中FABP5/CRABP2表达比例判断肿瘤对 维甲酸疗效的敏感度，或通过抑制FABP5的表达， 促进CRABP2的表达，以降低FABP5/CRABP2比 例，从而促进维甲酸促分化信号通路的活化，以增 加维甲酸的治疗敏感度，并以此作为可能治疗策 略，展开相应研究。