肿瘤防治研究  2015, Vol. 42 Issue (3): 238-241
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管，湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

汪珊珊，彭朝阳，张宁波，陈丽芳，张丽沙，李伟. 2015.
WANG Shanshan, PENG Zhaoyang, ZHANG Ningbo, CHEN Lifang, ZHANG Lisha, LI Wei. 2015.
小分子化合物PHA-767491对白血病K562细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用
PHA-767491 Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis of Leukemia Cells K562
肿瘤防治研究, 2015, 42(03): 238-241
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42(03): 238-241
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2015.03.006

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收稿日期：2014-03-24
修回日期：2014-10-23
引用本文
汪珊珊，彭朝阳，张宁波，陈丽芳，张丽沙，李伟. 小分子化合物PHA-767491对白血病K562细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用[J]. 肿瘤防治研究, 2015, 42(03): 238-241.
WANG Shanshan, PENG Zhaoyang, ZHANG Ningbo, CHEN Lifang, ZHANG Lisha, LI Wei. PHA-767491 Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis of Leukemia Cells K562. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42(03): 238-241.
小分子化合物PHA-767491对白血病K562细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用
汪珊珊1, 彭朝阳2, 张宁波1, 陈丽芳1, 张丽沙1, 李伟2    
1.311202 杭州，浙江萧山医院肿瘤放疗科；
2.310003 杭州，浙江大学医学院附属儿童医院检验科
收稿日期：2014-03-24；修回日期：2014-10-23
基金项目：国家自然科学基金项目(81200486)；浙江 省自然科学基金项目(Y2100891)
作者简介: 汪珊珊（1985-），女，本科，护师，主要 从事肿瘤临床治疗和护理研究
摘要：目的 探讨PHA-767491对白血病细胞K562的抑制能力及分子机制。方法 采用不同浓度 的PHA-767491作用于K562细胞，利用MTT法在不同的时间点检测细胞存活率，RT-PCR及Western blot检测PHA-767491诱导的凋亡信号途径，hochest染色及流式细胞术检测K562的凋亡水平。结果 PHA-767491显著抑制K562细胞的增殖，进一步结果表明PHA-767491可以显著下调抗凋亡蛋白Xiap和 Mcl-1蛋白的表达水平，诱导K562细胞通过Caspase途径进入凋亡。结论 PHA-767491可以通过诱导 K562细胞凋亡而显著抑制其增殖，为今后的白血病治疗提供了一种新的备选药物。
关键词： Cdc7激酶     PHA-767491     K562     凋亡    
PHA-767491 Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis of Leukemia Cells K562
WANG Shanshan1, PENG Zhaoyang2, ZHANG Ningbo1, CHEN Lifang1, ZHANG Lisha1, LI Wei2    
1.Department of Radiation Oncology, Xiaoshan Hospital of Zhejiang, Hangzhou 311202, China;
2.Clinical Laboratory, The Children’s Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China
Abstract：Objective To explore the anti-tumor effect and the mechanism of PHA-767491 against leukemia cells K562. Methods After different concentration of PHA-767491 acted on K562 cells, cell survival rate was detected by MTT at different time, the apoptosis signal pathway was examined by RT-PCR and Western blot, and cell apoptosis was checked by hochest staining and flow cytometry. Results PHA-767491 inhibited the proliferation of K562 cells significantly, by the way of reducing the expression levels of antiapoptotic protein Xiap and Mcl-1 significantly, and inducing cell apoptosis through Caspase pathway. Conclusion PHA-767491 could inhibit the proliferation of K562 cells significantly through inducing cell apoptosis, thus, it could be a new alternative leukemia drug in the future.
Key words: Cell division cycle 7(Cdc7)     PHA-767491     K562     Apoptosis    
0 引言

肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程，在这 一过程中有多种调控因子参与，Cdc7 激酶（cell division cycle 7）就是一个重要的细胞周期调控因 子，Cdc7激酶可以通过磷酸化激活MCM家族的 多个成员来促进细胞周期的起始，研究表明Cdc7 在肿瘤细胞的增殖过程中具有重要作用，Cdc7已 被认为是今后的肿瘤治疗中很有前景的靶标[1, 2, 3, 4]。 PHA-767491是类似ATP分子构型的一类小分子 化合物，其作为Cdc7激酶的抑制剂对多种肿瘤细 胞表现出了极强的抑制能力，不仅可以通过抑制 Cdc7而抑制肿瘤细胞的增殖，也可以通过抑制 CDK9而促进肿瘤细胞的凋亡[5, 6, 7, 8]。慢性髓系白血病 细胞K562具有很强的增殖和耐药能力，本研究将 PHA-767491作用于K562细胞，探讨其对K562细胞 增殖的抑制能力，并进一步研究其作用机制。 1 材料与方法 1.1 材料

K562细胞为本实验室所有，PHA-767491购 自Tocris公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自 Sigma公司，二甲基亚砜（DMSO） 购自无锡展 望化工试剂有限公司，Hochest33342购自Amresco 公司，Caspase-3一抗购自CST公司，β-actin一抗 购自Apitomics公司，DMEM培养液购自Gibco公 司，Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自 Ferments公司，sygreen荧光定量PCR试剂盒购自 TOYOBO公司，Mcl-1一抗购自Santa cruz公司， Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自Becton Dickinson公司。 1.2 细胞增殖的检测

用含10%血清的DMEM按105/ml将K562细胞稀 释后，以每孔100 μl接种到96孔板中，培养12 h后， PHA-767491按5、10、15、20、25 μmol/L的5个浓 度，不加药为对照组，每组均设6个复孔。培养 48 h后每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液20 μl， 37℃孵育4 h后吸去上清液，各孔分别加入150 μl的 DMSO溶液，在摇床摇育20 min，酶标仪590 nm检 测A590值。相同实验重复两次。对照组，将浓度为5 μmol/L 的PHA-767491加入96孔板中，每组均设6个 复孔。分别于24、48和72 h用MTT法检测细胞存活 率，方法同上。 1.3 qRT-PCR检测Xiap和Mcl-1的mRNA水平

在六孔板中接种5×105个K562 细胞，培养 12 h后，在PHA-767491组中加入5 μ m o l / L的 PHA-767491，加等体积磷酸盐缓冲液于对照组， 37℃培养24 h后，吸去细胞培养液，利用Trizol 抽提细胞总RNA，总RNA按照Fermentas公司的 cDNA合成试剂盒操作说明进行mRNA的反转 录，转录产物进行相关基因表达水平的荧光定量 PCR(ABI7300)分析，内参为GAPDH。其中Xiap基 因的引物序列为：上游：5’-GGTGA TAAAGTAA AGTGCTTTCACTGT-3’，下游：5’-TCAGTAGTTC TTACCAGACACTCCTCAA -3’。Mcl-1基因的引物序 列为：上游：5’-CTTTTGGCTACGGAGA AGGAG-3’, 下游：5’- GAGTCTGGCGTGAGGGTG-3’；GAPDH 基因的引物序列为:上游：5’ - CATGAGAAG TATGACAACAGCCT-3’，下游：5’-AGTCCTTCCAC GATACCAAAGT-3’。 1.4 Western blot检测相关蛋白的表达

在六孔板中接种5×105个K562细胞12 h后， PHA-767491组加5 μmol/L的PHA-767491，对照 组加等体积的磷酸缓冲液，37℃培养24 h后，吸 去培养液，加入细胞裂解液，冰浴1 min后，刮下 细胞，所有液体移至EP管中，13 000 r/min离心5 min，取上清液定量，加入loading buffer于12%的 SDS-PAGE 电泳后转膜。用10%的牛血清封闭过 夜，分别加入1∶1 000的Caspase-3抗体、Mcl-1抗 体以及β-actin抗体，37℃摇育2 h。TBST洗两遍， 加入荧光二抗，37℃摇育1 h。TBST洗两次，在红 外激光成像系统进行蛋白分析。 1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡水平

在六孔板中接种5×105个K562细胞，加药组加 5 μmol/L的PHA-767491，对照组加等体积的磷酸 盐缓冲液，37℃培养24 h后，吸去培养液，用预冷 的PBS洗两遍，加入胰酶将细胞从壁上消化下来后 加入400 μl的1×binding buffer将细胞吹匀悬浮，分 别加入1.5 μl的Annexin V和1.5 μl的PI。遮光室温 置15 min后，流式细胞仪分析。 1.6 统计学方法

相同实验重复三次，使用SPSS 11.0统计软件 进行分析，组间比较采用t检验。 2 结果 2.1 细胞增殖检测

细胞增殖和抑制实验结果见图 1。如图 1A所示， 随着PHA-767491浓度的逐渐增加，K562细胞存活 率逐渐降低（P<0.05），表明PHA-767491对K562 细胞有较强的杀伤力。同时，图 1B显示5 μmol/L 的PHA-767491处理K562细胞后，PHA-767491可 以长时间的抑制K562细胞的增殖。以上结果显示 PHA-767491可以长期高效地抑制K562细胞的增殖。

A：Concentration gradient of PHA-767491；B：Time gradient of PHA-767491 图 1 PHA-767491抑制K562细胞增殖 Figure 1 Proliferation of K562 cells inhibited by PHA-767491
图选项
2.2 PHA-767491下调Xiap和Mcl-1的表达

PHA-767491处理K562细胞后，抗凋亡蛋白 Xiap和Mcl-1的表达实验结果见图 2。如图 2A所 示，PHA-767491处理K562细胞后，抗凋亡蛋白 Xiap和Mcl-1的mRNA水平被显著下调（P<0.05）。 Western blot结果表明，PHA-767491处理K562细胞 后，Xiap和Mcl-1蛋白表达水平被显著抑制，且随着PHA-767491浓度的增大，Xiap和Mcl-1蛋白表达被 抑制增强，且随浓度的增加，发生凋亡细胞的数量 显著增加，见图 2B。以上结果显示，PHA-767491可 以显著下调抗凋亡蛋白Xiap和Mcl-1的表达。

Xiap: X-linked inhibitor of apoptosis protein; Mcl-1: myeloid cell leukemia-1；A:Xiap and Mcl-1 mRNA levels down-regulated by PHA-767491;B:Protein expression levels of Xiap and Mcl-1 downregulated by PHA-767491 图 2 PHA-767491下调Xiap和Mcl-1的表达 Figure 2 Expression of Xiap and Mcl-1 down-regulated by PHA-767491
图选项
2.3 PHA-767491诱导K562细胞凋亡

PHA-767491诱导K562细胞凋亡实验结果见 图 3。图 3A为不同浓度PHA-767491作用48 h后， 诱导K562细胞凋亡程度的比较。作为荧光探针 的Hoechst 33342可与DNA分子结合，可见细胞凋 亡过程中细胞核发生片段化，且随浓度的增加， 发生凋亡细胞的数量显著增加，见图 3A箭头所 指。图 3B为浓度为2.5 μmol/L的PHA-767491作用 于K562细胞的不同时间，细胞发生凋亡程度与 空白对照的比较。Hoechst染色结果表明，随着 PHA-767491作用时间的增加，出现核小体凋亡的 K562细胞显著增多，见图 3B箭头所指。

A: concentration gradient of PHA-767491; B: time gradient of PHA-767491 图 3 hoechst33342检测K562细胞凋亡现象 Figure 3 Apoptosis of K562 cells examined by examined fluorescent probe hoechst33342
图选项
2.4 PHA-767491通过Caspase3途径诱导K562细胞凋亡

PHA-767491处理K562细胞后，Annexin V和 PI双染后流式细胞仪检测结果表明，PHA-767491 可以明显诱导K562细胞凋亡，进一步检测细胞 凋亡信号通路表明，PHA-767491可以显著诱导 Caspase3蛋白的降解，实验结果见图 4。

A:The apoptosis levels of K562 cells were detected by flow cytometry; B: The effect of PHA-767491 on the expression of Caspase3 图 4 流式细胞仪检测PHA-767491诱导K562细胞凋亡 Figure 4 PHA-767491 induced the apoptosis of K562 cells detected by FCM
图选项
3 讨论

肿瘤细胞DNA复制中的一些关键因子已成为 肿瘤治疗的关键靶点。作为DNA复制起始复合 物激活因子的Cdc7激酶，其过度激活大大促进了 肿瘤细胞的增殖。多个研究表明，Cdc7是肿瘤 中一个重要的靶标[1, 2, 3]。2008年Vanotti E最先发现 PHA-767491是类似ATP分子构型的一类小分子 化合物，其具有最佳的分子构型，可以竞争性地 与Cdc7结合，抑制Cdc7结合ATP进而导致Cdc7 失去磷酸化能力[4]。Montagnoli[3]进一步研究发现 PHA-767491在肿瘤细胞中可以高效地抑制Cdc7和 CDK9的磷酸化能力，Cdc7和CDK9被抑制后，细 胞增殖被显著抑制，细胞凋亡率显著升高[3]。本课 题组先前的研究结果表明，PHA-767491对多种实 体瘤细胞表现出了极强的杀伤抑制能力[5]。

慢性髓系白血病细胞K562由于多个信号通 路过度激活，导致其具有极强的耐药性和抗凋亡 能力。本研究利用抗肿瘤新药PHA-767491处理 K562细胞，以期利用PHA-767491极强的抗肿瘤 能力，抑制K562细胞的增殖。本研究结果显示， PHA-767491可以显著抑制K562细胞的增殖，而且 这种抑制能力随着时间和浓度的增加而增强。进 一步研究PHA-767491抑制K562细胞的分子机制发 现，PHA-767491处理K562细胞后，Xiap和Mcl-1 蛋白的表达被显著下调，Xiap和Mcl-1是重要的抗 凋亡蛋白，其被下调后我们发现K562细胞凋亡途 径中的Caspase3剪切水平显著上升，细胞凋亡水 平显著增加。故PHA-767491对K562细胞较强的 抑制杀伤作用可能表现在以下两个方面：（1） PHA-767491抑制Cdc7后，K562细胞的细胞周期被 抑制，生长减缓[3]。（2）PHA-767491抑制CDK9 后，其下游的抗凋亡蛋白Xiap和Mcl-1被显著下 调，这也大大增加了K562细胞的凋亡水平。

本研究结果表明C d c 7 和CDK9 的抑制剂 PHA-767491可以显著抑制K562细胞的增殖，并可 以显著诱导K562细胞通过caspase途径凋亡。同时， 多个研究表明，Cdc7激酶和肿瘤的耐药性有很密切 的关系[2, 7]，而我们先前的研究表明PHA-767491联合 其他药物具有很强的协同抑制肿瘤的能力[6]。上述 结果提示PHA-767491可以作为一个很有前景的候 选药物用于今后的白血病治疗。

参考文献
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