蛋白磷酸酶2A抑制剂-2（inhibitor of protein phosphatase2 A-2,I2PP2A），又称SET（patient SE translocation）基因^[1]、模板活化因子-1（template activating factor 1β，TAF1β）^[2]等。 通过对不同 肿瘤组织进行I2PP2A cDNA表达分析，发现在子 宫、胃、结肠、直肠肿瘤组织，I2PP2A的表达是 相应正常组织的2倍或更高^[3]。目前对于I2PP2A基因和蛋白表达、功能调控的机制研究尚不丰富。 为此，本研究进一步探讨沉默I2PP2A基因表达对 人胃癌细胞增殖和迁移能力的影响，并探讨其可 能的分子机制，为I2PP2A成为预防和治疗胃癌的 新靶点提供必要的实验依据，也为最终阐明胃癌 发生和发展机制奠定理论基础。 1 材料和方法 1.1 材料

靶向I2PP2A的shRNA表达载体为本实验室 保存，阴性对照（shRNA_con）经BLAST检测 证实与I2PP2A mRNA及其他基因编码序列无同 源性。shRNA序列：shRNA_con 正义5’-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG- 3’; 反义5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAAGCTG T C A C G TA AT C T C T T G A C G T G A C A C - GTTCGGAGAAC-3’ ；shRNA_I2PP2A正义 5’-CACCGCTCTAATGCCAAGTTATACATTCAAGAGATGTATAACTTGGCATTAGAGCTTTTTTG- 3’ 反义5’-GATCCAAAAAAGCTCTAATGCCAAGTTATACATCTCTTGAATGTATAACTTGGCATTAGAGC- 3’。胃癌细胞株MKN-28（高分化）、AGS （中分化）和BGC-823（低分化）和正常胃黏膜 上皮细胞GES-1购自美国ATCC公司；去内毒素质 粒大量提取试剂盒为德国Qiagen公司产品；质粒 转染试剂Lipofectamine^TM2000购自美国Invitrogen 公司；抗体I2PP2A、β-actin以及辣根过氧化物酶 标记的羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司；抗体 cyclin D1购自美国CST公司；抗体MMP-9购自美 国PTG公司。 用于Western blot检测的增强化学发 光试剂ECL和BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce 公司；PVDF转印膜购自美国Millipore公司；引物 合成由上海英骏生物技术有限公司完成；WST-1细 胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自武汉博士德生 物工程有限公司；Transwell小室（24孔,8 μm）购 自美国Corning公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞转染

细胞传至6孔板,在对数生长期 进行转染，采用Lipofectamin^TM2000脂质体转染 试剂，按质粒: 转染试剂为1.6 μg∶5 μl的比例配 比转染，将shRNA_I2PP2A表达质粒瞬时转染入 BGC-823细胞，同时转染shRNA_con质粒为对照， 细胞转染24 h后置于荧光显微镜下观察，计算转 染效率。转染效率=（发出绿色荧光的细胞数/可 见光下的总细胞数）×100%，转染后细胞分为三 组: 未转染组（blank）；转染对照shRNA_con组 （siRNA con）和转染shRNA_I2PP2A组（siRNA I2PP2A）。 1.2.2 Real-time RT-PCR

收集三组胃癌BGC-823 细胞，以TRIzol试剂提取细胞总RNA，紫外分 光光度计定量RNA，琼脂糖凝胶电泳验证RNA 完整性。以基因特异性引物进行PCR扩增，检 测结果用Δ ΔCt值判定，以GAPDH作为内参。 I2PP2A引物序列：上游引物为5’-CAGAAGAGGTCAGAATTGATCGC- 3’，下游引物为5’-TGGTTGACAAATGTTGTTACCCA- 3’，扩增片段长 度为62 bp。GAPDH引物序列: 上游引物为5’- CATGAGAAGTATGACAACAGCCT- 3’，下游引物为5’- AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’，扩增片段长 度为113 bp。PCR扩增产物电泳结果显示PCR产物 大小正确，无杂带说明无非特异性扩增，实验重 复3次。 组间表达差异通过计算2^-ΔΔCt予以表示。 1.2.3 蛋白质印迹分析

收集对数生长期的正常 胃黏膜上皮细胞GES-1和3株胃癌细胞MKN-28、 AGS和BGC-823，以及转染后的三组胃癌BGC-823 细胞，分别利用细胞裂解液提取细胞的总蛋白， 进行SDS-PAGE电泳，电泳后湿转至PVDF膜， 含5%脱脂奶粉的TBS-T(含0.05% Tween-20的 TBS)37℃封闭60 min，加1∶1 000稀释的抗I2PP2A 蛋白的多克隆抗体4℃孵育过夜。TBS-T漂洗5 min ×3次，加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记 的羊抗兔IgG 37℃孵育45 min。TBS-T漂洗5 min ×3次，ECL化学发光试剂检测。图像应用Gel-Pro Analyzer软件进行灰度分析，目的蛋白表达的相对 强度=目的条带的灰度值/β-actin条带的灰度值。 1.2.4 细胞增殖实验

取96孔细胞培养板内对数 生长期的三组细胞，按照WST-1细胞增殖检测试剂 盒说明书进行，在全自动酶联免疫检测仪上测定 波长450 nm处吸光度值。细胞生长抑制率=（对照 组A₄₅₀值－实验组A₄₅₀值）／对照组A₄₅₀值×100%。 1.2.5 细胞迁移实验

实验在Transwell小室中进 行，滤膜孔径为8 μm。 将三组BGC-823细胞分别 悬浮在含BSA的无血清培养液中并调整浓度至5× 10⁴/ml，6孔板下室加入1 ml含FBS的培养液，细 胞悬液2 ml接种于Transwell小室，置于细胞培养 箱中培养72 h后取出小室。 用棉签擦去上室内的 细胞，预冷甲醇固定15~20 min。苏木精染色10 min。小室风干后放入孔中，倒置显微镜下取5个 视野，拍照计数。最后通过计算滤膜下层的细胞数来评估其迁移的细胞数目。 1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行方差分析、t检 验。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 胃癌细胞中I2PP2A蛋白表达的检测

胃癌细胞株BGC-823、AGS和MKN-28中 I2PP2A蛋白表达水平均高于正常胃黏膜上皮细 胞GES-1,且差异具有统计学意义（P=0.000； 0.019；0.001）。此外,胃癌BGC-823细胞中 I2PP2A蛋白的表达水平高于MKN-28和AGS细胞, 差异有统计学意义（P=0.003；0.000），见图 1。

A: Western blot; B: Quantitative analysis; *: P<0.05,compared with GES-1 cells; Δ: P<0.05,compared with BGC-823 cells 图 1 正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞中I2PP2A蛋白的表达 Figure 1 Expression of I2PP2A protein in normal gastric mucosal epithelial cells and gastric carcinoma cells

图选项

BGC-823细胞转染重组质粒24 h后,荧光显微 镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞所占比例，见图 2。重组质粒24 h转染效率为70%以上。

A: normal view; B: fluorescence view 图 2 重组质粒转染BGC-823细胞后绿色荧光蛋白的表达 Figure 2 The expression of green fluorescent protein (GFP) in BGC-823 cells transfected with recombinant plasmids

图选项

Real-time RT- PCR结果显示重组质粒 shRNA_I2PP2A对BGC-823细胞I2PP2A mRNA的表 达有显著的抑制效果，见图 3。

* : P<0.01,compared with blank and siRNA con groups 图 3 Real-time RT-PCR检测I2PP2AmRNA的表达 Figure 3 I2PP2A mRNA expression detected by real-time RT-PCR

图选项

Western blot结果显示重组质粒shRNA_I2PP2A 对BGC-823细胞I2PP2A mRNA的表达有显著的抑 制作用，见图 4。

A: Western blot; B: Quantitative analysis; 1: blank; 2: siRNA con; 3: siRNA I2PP2A; *: P<0.01,compared with blank and siRNA con groups 图 4 Western blot检测I2PP2A蛋白的表达 Figure 4 I2PP2A protein expression detected by Western blot

图选项

siRNA con与blank两组间比较差异无统计学意 义（P=0.288），而siRNA I2PP2A与siRNA con、 blank组相比差异均有统计学意义（P=0.000； P=0.000），提示下调I2PP2A基因对BGC-823细胞 增殖具有明显抑制作用。应用上述公式计算细胞生 长抑制率，siRNA I2PP2A组约为57.6%，见表 1。

表 1 WST-1法检测siRNA对BGC-823细胞的增殖抑制作用 Table 1 Inhibitory effect of transfected siRNA on the proliferation of BGC-823 cells tested by WST-1 assay

表选项

细胞迁移实验结果显示,与未转染组（细胞数 130±7.8）及对照siRNA con组（细胞数129±5.9） 相比，siRNA I2PP2A组中胃癌BGC-823细胞的穿膜数（62±6.6）下降（P=0.000；P=0.000），而未 转染组及对照siRNA con组之间细胞穿膜数差异无 统计学意义（P=0.894），见图 5。

A: transwell assay; B: counting statistics of penetrating cells; *: P<0.01, compared with blank and siRNA con groups 图 5 Transwell小室检测I2PP2A基因沉默对胃癌BGC-823细胞迁移能力的影响 Figure 5 Effect of I2PP2A gene silencing on migration of BGC-823 cells detected by transwell chamber

图选项

转染后48ｈ,siRNA I2PP2A组中cyclin D1和 MMP-9蛋白的表达均低于未转染组（blank）和对 照siRNA组（Cyclin: P=0.000；P=0.000；MMP-9: P=0.000；P=0.000）,而未转染组和对照siRNA con 组之间cyclin D1和MMP-9蛋白的表达差异无统计 学意义（P=0.116；P=0.881），见图 6。

A: Western blot; B: Quantitative analysis; 1: blank; 2: siRNA con; 3: siRNA I2PP2A; *: P<0.01,compared with blank and siRNA con groups 图 6 I2PP2A表达下调对BGC-823胃癌细胞中cyclin D1和MMP-9蛋白表达的影响 Figure 6 Effect of down-regulated I2PP2A expression on expression of cyclin D1 and MMP-9 proteins in gastric carcinoma cells BGC-823

图选项

I2PP2A与多种生物活动相关，如细胞周期调控^[4]、 细胞凋亡^{[5, 6, 7]}、迁移^{[8, 9]}和DNA损伤修复^[10]及氧化应 激^[11]等多个生物过程，是重要的细胞因子。Cervoni 等^[3]报道，在胃肿瘤组织，I2PP2A mRNA表达是相 应正常组织的2倍以上，因此下调在胃癌中过表达 的I2PP2A可作为一个潜在的肿瘤治疗靶点。

I2PP2A在人胃癌中的作用报道较少。本研 究结果显示,在RNA干扰技术特异性沉默I2PP2A 的表达后，胃癌细胞的增殖能力明显下降，这与 胰腺癌、人乳腺癌和头颈部鳞状细胞癌中的结果 一致^{[11, 12, 13]}，但是上述变化的具体分子机制尚不清 楚，因此我们进一步利用蛋白质印迹分析检测 细胞增殖相关蛋白cyclin D1表达的变化，结果发 现，I2PP2A表达下调能抑制cyclin D1蛋白的表 达，细胞周期循环由细胞周期蛋白cyclins严格控 制，cyclin D1控制着G₁/S期，cyclin D1蛋白表达下 降，使细胞停滞在G₁期，因此推测增殖能力的减 弱主要是由于细胞被阻滞在G₁期。

基质金属蛋白酶（MMPs）在恶性肿瘤中过度表 达，已被证明有助于肿瘤的增殖、侵袭和转移^[14]， MMPs，MMP-9与肿瘤的转移密切相关，被认为 是促进胃癌侵袭和转移的重要因素^{[15, 16, 17]}。本研究结果显示，下调I2PP2A的表达后，细胞迁移相关 蛋白MMP-9表达明显下降，细胞的迁移能力明显 下降，提示I2PP2A表达下调介导的迁移能力降低 可能与MMP-9蛋白表达的下降密切相关。然而， 最近Sobral等^[11]在头颈部鳞状细胞癌研究中发现， 在HN12细胞中，过表达I2PP2A促进肿瘤生长的 同时限制细胞的迁移和侵袭，而敲除I2PP2A可上 调MMP-2和MMP-9的表达，与本研究的结果不一 致，这可能是由于组织、细胞类型的种属特异性 造成的。

综上所述，I2PP2A基因对增殖和迁移的调控可 能与cyclin D1和MMP-9蛋白表达密切相关，此发现 有助于我们进一步理解I2PP2A基因致胃癌作用的 具体机制，为开展以I2PP2A作为一个新的胃癌标 志物和以I2PP2A基因为靶点的胃癌基因治疗提供 实验依据，详细的机制有待于进一步实验研究。