非肌性肌球蛋白重链9（myosin,heavy chain 9, non-muscle,MYH9）被认为是细胞骨架的一个重要 组成蛋白，MYH9通常与actin组成actomyosin，构 成细胞骨架中的应力纤维^{[1, 2, 3]}。MYH9已被发现的功 能包括影响细胞形态、细胞黏附、细胞延展、细胞 运动等。MYH9蛋白主要包括一个N端头部区，主 要结合actin，具有ATPase活性；C端杆区，通常形成 coil-coil，并与其他蛋白结合^{[4, 5, 6]}。

近期有研究报道，人MYH9蛋白分布于耳蜗 细胞和肾细胞的线粒体中，而且密集分布于线粒 体内膜^[7]。除免疫电镜的结果和Western blot的结果 外，该研究的免疫共沉淀结果显示，人MYH9蛋白 与线粒体内膜蛋白、酮戊二酸脱氢酶（OGDH） 相互结合。本研究旨在通过免疫共沉淀实验、 GST-pull down实验及蛋白质质谱分析等方法，分析MYH9蛋白在食管癌细胞内线粒体中的分布及是 否与线粒体相关蛋白SLP-2的结合。 1 材料与方法 1.1 细胞系和主要试剂

Protein A微珠、 Glutathione-Agarose微珠购自美国Sigma公司。 GST-SLP-2融合蛋白和抗人SLP-2抗体购自美 国Proteintech Group公司；抗人MYH9抗体、抗 人Fis1抗体及抗人LDH抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。食管癌细胞系KYSE150细胞 使用RPMI 1640培养液添加10%胎牛血清、100 μg/ml 链霉素和100 u/ml青霉素，培养于5% CO2、 37℃的培养箱中。 1.2 免疫共沉淀实验

细胞在裂解液[50 mM Tris （pH8.0），150 mM NaCl,1%NP-40，0.1%SDS, 100 μg/ml PMSF,2 μg/ml aprotinin,2 μg/ml leupeptin，2 μg/ml pepstatin A]中冰上裂解60 min。 细胞裂解液4℃，12 000 g，离心15 min，计算待测 样品的蛋白浓度。将蛋白样品调整到1 mg/ml的浓 度，在每毫升蛋白溶液中加入30 μl Protein A微珠， 4℃下在摇床上振摇孵育3 h以进行预清除。然后 4℃，1 000 g，离心5 min，保留上清液。在1 ml上 清液中加入1μg抗SLP-2抗体（或者同种属无关抗 体以作为对照），4℃下在摇床上振摇孵育过夜。 次日，在每毫升溶液中加入30 μl Protein A微珠， 4℃下在摇床上振摇孵育3 h，使Protein A微珠与抗 体-抗原结合物充分结合。然后4°C，1 000 g，离 心5 min，保留微珠。在微珠中加入1 ml 1% Triton X-100 PBS 洗液，重悬微珠，4℃下在摇床上振摇 洗涤15 min。重复洗涤三次。然后彻底去除上清 液，在微珠中加入2×Western上样缓冲液，100℃煮 沸10 min，备用。 1.3 蛋白质质谱分析

将免疫共沉淀样品使用 10%的SDS-PAGE胶分离以后，考马斯亮蓝染色。 对比SLP-2抗体组与对照组，选出SLP-2抗体组中分 离明显而对照组中没有的条带，将其割下，凝胶切 成1.5 mm³大小，送样进行MALDI-TOF-MS分析。 将结果在数据库中进行比对，根据蛋白得分和分子 量等结果比对出最有可能和SLP-2结合的蛋白。 1.4 GST pull down实验

细胞裂解后，将蛋白样 品调整到1 mg/ml的浓度，每毫升蛋白溶液中加入 30 μl Glutathione-Agarose微珠，4℃下在摇床上振 摇孵育3 h进行预清除。然后4℃，1 000 g，离心 5 min，保留上清液。在1 ml上清液中加入30 μg GST-SLP-2融合蛋白（或者GST蛋白作为对照）， 4℃下在摇床上振摇孵育过夜。次日，在每毫升溶 液中加入30 μl Glutathione-Agarose微珠，4℃下在 摇床上振摇孵育3 h，使Glutathione-Agarose微珠与 GST-SLP-2融合蛋白及结合蛋白充分结合。然后 4℃，1 000 g，离心5 min，保留微珠。在微珠中加 入1ml 1% Triton X-100 PBS 洗液，重悬微珠，4℃ 下在摇床上振摇洗涤15 min。重复洗涤三次后去 除上清液，在微珠中加入2×Western上样缓冲液， 100°C煮沸10 min，Western blot检测。 1.5 细胞线粒体分离

倾去培养液，使用PBS洗 涤三次后，再用0.25 M蔗糖溶液清洗三次，然后加 入0.25 M蔗糖溶液将KYSE150细胞从培养皿中刮 下。将细胞悬液放入玻璃匀浆器中进行匀浆。匀 浆液4℃，1 000 g，离心15 min，去除细胞核。上 清液4℃，10 000 g，离心20 min，沉淀为纯化分离 的细胞线粒体，上清液为剩余细胞质成份，两者 做Western blot检测。 1.6 Western blot检测

计算待测样品的蛋白浓度， 定量后的蛋白样品加入2×Western上样缓冲液，经 100℃煮沸变性10 min，进行SDS-PAGE电泳。电泳 后，用转移电泳装置将蛋白转移至PVDF膜，恒定电 压100V，1 h。PVDF膜在5%脱脂奶粉TBS（pH7.5） 溶液中室温封闭1 h，加入一抗（用含5%脱脂奶粉 TBS，pH7.5稀释） 4℃ 过夜，用TTBS[20 mM Tris （pH7.5），200 mM NaCl，0.1%Tween-20]洗6次，每 次5 min。然后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的 第二抗体（用含5%脱脂奶粉TBS，pH7.5稀释）孵育 1 h，再用TTBS缓冲液洗6次，每次5 min。将ECL化 学发光试剂盒中的A液和B液等量混合，加到膜上。 对化学发光信号进行采集。 2 结果 2.1 蛋白质质谱分析结果

KYSE150细胞裂解液加入抗SLP-2抗体后，将 共沉淀物送样进行MALDI-TOF-MS分析。蛋白质 质谱分析结果经与数据库比对，显示人MYH9蛋 白可能与SLP-2蛋白相互结合，见图 1。图 1B横坐 标表示蛋白的得分（检测到的所有肽段与数据库 进行配对），得分高代表结果可信度高。同时将 检测到蛋白的等电点与分子量数值和SDS-PAGE电 泳结果相对照。图 1B是对肽指纹图谱结果的评估 图，在斜线阴影框中显示的是不可信结果，得分 超过65分为可信结果。Y轴高度表示具有同一得分 的不同蛋白种类数。得分相同蛋白多是同源性蛋 白。根据结果，判断人MYH9蛋白与SLP-2蛋白有 相互结合。

A: peptide mass fingerprinting; B: score for peptide mass fingerprinting 图 1 蛋白质质谱分析使用抗SLP-2抗体得到的免疫共沉淀物的结果 Figure 1 Matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry analysis of co-immunoprecipitation of anti-SLP-2 antibody

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使用免疫共沉淀实验和GST-pull down实验进 一步验证人MYH9蛋白是否与人SLP-2蛋白相互结 合。在免疫共沉淀实验中，首先使用抗SLP-2抗 体去沉淀与SLP-2蛋白结合的蛋白，然后经SDSPAGE 分离，用抗人MYH9抗体进行Western blot 检测，发现与SLP-2蛋白共沉淀的分子中，包含人MYH9蛋白，见图 2A。然后再反向使用抗人 MYH9抗体进行免疫共沉淀，使用抗人SLP-2抗体 进行Western blot检测，发现与人MYH9蛋白共沉淀 的分子中，包含SLP-2蛋白，见图 2B。进一步使用 GST-SLP-2融合蛋白进行GST-pull down实验，然后 使用抗人MYH9抗体进行Western blot检测。GSTSLP- 2融合蛋白的结合物中，包含人MYH9蛋白。 这些结果显示，SLP-2蛋白与MYH9蛋白有直接或 者间接的结合，见图 2C。

Co-immunoprecipitation and GST-pull down assay verified the binding between MYH9 and SLP-2. IP: Immunoprecipitation; Blot: Western blot; Input: cytolysate; GST: GST-pull down 图 2 免疫共沉淀实验与GST-pull down实验结果 Figure 2 Results of Co-immunoprecipitation and GST-pull down assay

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通过蔗糖密度离心法，将KYSE150细胞的线 粒体和细胞质分开，进行Western blot检测。以人 Fis1为线粒体标志物，人LDH为细胞质标志物， 使用抗人Fis1抗体、抗人LDH抗体及抗人MYH9抗体，检测人MYH9蛋白在KYSE150细胞中的分布。 人MYH9蛋白在KYSE150细胞中既分布于细胞质 中，同时也有一部分分布于线粒体中，见图 3。

Western blot result showed that parts of MYH9 protein distributed in the mitochondria of ESCC cell lines KYSE150; MYH9: myosin, heavy polypeptide 9; Fis1: fission 1 homolog protein; LDH: lactate dehydrogenase 图 3 Western blot法检测食管癌细胞线粒体中MYH9蛋白的分布 Figure 3 Distribution of MYH9 protein in ESCC mitochondria detected by Western blot

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本研究首先通过免疫共沉淀的方法，取得 了食管鳞癌KYSE150细胞中与线粒体相关蛋白 SLP-2直接或间接结合的一系列蛋白。再通过SDSPAGE 分离以后，结合蛋白质质谱分析，结果显 示人MYH9蛋白可能与SLP-2蛋白有结合。使用抗 SLP-2抗体共沉淀，抗MYH9抗体Western blot检 测；或反之使用抗MYH9抗体共沉淀，抗SLP-2抗 体Western blot检测，结果显示，在KYSE150细胞 中，MYH9蛋白与线粒体相关蛋白SLP-2有结合。 GST-pull down实验进一步证实了该结果。同时分 离纯化KYSE150细胞线粒体后，Western blot检测 结果发现，MYH9蛋白部分存在于KYSE150细胞的线粒体中。

MYH9作为肌球蛋白的重链，主要分布于细胞 质参与构成细胞骨架中的应力纤维。此前研究发 现，MYH9的功能包括影响细胞黏附延展和细胞 运动（cell motility）等，这些功能与MYH9蛋白影 响应力纤维有关^{[4, 5, 6]}。但我们的研究及近期其他一 些研究发现，MYH9蛋白除了定位于细胞应力纤维 外，还存在于线粒体中，与一些线粒体组份结合， 并可能影响线粒体活动^{[7, 8]}。也有研究报道，在小鼠 耳蜗细胞和肾细胞的线粒体中存在MYH9蛋白^[7]， MYH9蛋白主要存在于线粒体内膜，并与酮戊二酸 脱氢酶（oxoglutarate dehydrogenase,OGDH）有结 合，但该报道未阐明MYH9蛋白对OGDH功能的影 响。该研究同时认为耳蜗细胞中MYH9蛋白表达异 常可能影响线粒体功能，而引起耳聋，但具体机制 尚待阐明^[7]。另有报道称，在小鼠肝脏细胞线粒体 中也存在MYH9蛋白，并与线粒体DNA结合。该 研究同时发现，在人类HOS和HEK细胞中，MYH9 蛋白在线粒体中存在并与线粒体DNA结合，下调 MYH9蛋白会影响线粒体DNA的拓扑结构并增加 线粒体DNA拷贝数^[8]。该报道认为MYH9蛋白在 线粒体中可能形成类似于微丝的结构，对线粒体 DNA提供结构支持，对线粒体DNA的稳态维护起 着重要作用。

有研究报道，MYH9在食管癌细胞中较正常对 照细胞表达上升。并且，MYH9在食管癌细胞中的 表达增高与癌细胞淋巴结转移、癌细胞低分化及 肿瘤分期正相关，并且与较短的生存期相关。该 研究同时发现降低MYH9表达可以降低食管癌细胞 的运动迁移能力，研究者认为这与MYH9对食管癌 细胞骨架的影响有关^[9]。

本研究结果显示，食管癌细胞KYSE150中 MYH9蛋白部分分布于线粒体中，并与线粒体相 关蛋白SLP-2结合。人类SLP-2是在2000年首次由 Wang等从人红细胞中克隆发现的^[10]。以往研究显 示，SLP-2蛋白定位于线粒体中，SLP-2蛋白与线 粒体内膜蛋白prohibitin等直接结合，而且SLP-2蛋 白可能参与调节与其结合的蛋白的稳定性，并影 响线粒体呼吸链功能^{[11, 12]}。Prohibitin据报道对线粒 体DNA的稳态维护中起着重要作用^[13]，因此SLP-2 蛋白也间接具备影响线粒体DNA的能力。2009年 的一篇研究表明SLP-2能够影响线粒体的融合能 力，而线粒体的正常融合能力对于线粒体DNA的 维护非常重要^[14]。我们此前研究显示SLP-2的表达 变化，可以影响食管癌细胞线粒体的功能，并且 能够影响食管癌细胞的运动迁移、增殖能力及对 化疗药物的敏感度^[15]。

本研究证实MYH9蛋白在食管癌细胞KYSE150 中不仅存在于细胞骨架，也部分存在于细胞线粒体 中，并与线粒体相关蛋白SLP-2结合。根据本研究结 果及相关研究报道，我们推测MYH9蛋白有可能 通过影响SLP-2来调节食管癌细胞线粒体的功能。 MYH9蛋白对食管癌细胞功能的影响，不仅体现在 影响细胞骨架上^[9]，MYH9蛋白也可能通过SLP-2 及其他途径影响食管癌细胞线粒体融合能力、线 粒体DNA拷贝数及拓扑结构、线粒体呼吸链及线 粒体膜电位等。MYH9蛋白可能通过影响食管癌细 胞线粒体功能来调节细胞功能，对此我们还需要 进行深入的研究。