随着对肿瘤发生机制研究的不断深入，研究人 员发现慢性炎性反应在促进肿瘤的发生和进展中发 挥着重要的作用。许多肿瘤均已被证实起源于一系 列慢性炎性反应^[1]。Toll样受体（Toll-like receptors， TLRs）可介导对细菌及真菌感染的免疫^[2]，能够通 过对病原相关分子模式（PAMPs）进行模式识别， 最终激活NF-κB，进而参与肿瘤形成、凋亡抵抗及 化疗抵抗等过程。TLR4是人类发现的第一个TLRs 家族蛋白，其介导炎性反应，在多种肿瘤细胞系和 组织中表达上调促进肿瘤的发生和进展，如肝癌^[3]、 前列腺癌^[4]、卵巢癌^[5]、胃癌^[6]和肺癌^[7]等。因此本研究以TLR4为靶标，化学合成靶向TLR4的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA），沉默人肺 腺癌A549细胞中TLR4的表达，进一步检测TLR4沉 默对A549细胞凋亡及细胞周期的影响，以期为肺癌 的基因治疗提供新的靶点。 1 材料与方法 1.1 细胞系和试剂

人肺腺癌细胞系A549购于中国科学院典型 培养物保藏委员会。DMEM培养液、胎牛血清、 双抗、Trizol试剂和Lipofectamine2000均购于美 国Invitrogen公司；Real-time PCR试剂盒购于大 连TaKaRa公司；细胞培养瓶和培养板购于美国 Costar公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 和细胞周期试剂盒购自江苏碧云天公司；小鼠抗 人TLR4单克隆抗体（ab22048）购于美国ABcam 公司；FITC标记的兔抗小鼠Ⅱ抗购于北京鼎国昌 盛生物技术有限公司。 1.2 细胞培养

A549细胞培养于含10%胎牛血清、100 u/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养液中， 37℃、5%CO2饱和湿度培养，常规消化传代，选 取处于指数生长期细胞进行实验。 1.3 TLR4-siRNA的设计合成

siRNA目的片段的选取及合成：根据GenBank 数据库提供的人TLR4全长基因设计RNAi的靶 区，Blast查询验证，排除与其他基因同源。设 计一条TLR4-siRNA序列：sense 5’-GGGCUUA GAACAACUAGAATT-3’，antisense 5’-UUCUA GUUGUUCUAAGCCCTT-3’；另外设计一条阴 性对照（negative control，NC）序列：sense 5’- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，antisense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’，以上核酸 分子由上海吉玛制药有限公司设计合成。 1.4 实验分组及细胞转染

实验分为：NC组和TLR4-siRNA组。（1） 转染前一天，取生长状态良好的指数生长期A549 细胞，胰酶消化，将其接种到6孔细胞培养板中 培养。（2）12~24 h后（融合度：50%~70%）， 弃完全培养液，PBS洗一次，加入1500 μl无抗 DMEM培养液培养。（3）5 μl Lipofectamine 2000与250 μl双无DMEM培养液混匀后，室温孵 育5 min。（4）NC组取5 μl NC-siRNA，TLR4- siRNA组取5 μl TLR4-siRNA与250 μl双无DMEM 培养液混匀后，室温孵育5 min。（5）将以上两 步（3）（4）所得溶液混匀，室温放置20 min， 即siRNA转染液。（6）将siRNA转染液加入已换 成无抗DMEM培养液的6孔板中，混匀，继续培养 4~6 h后，更换为无抗DMEM培养液培养。（7）24 h 后更换为含10% FBS的完全DMEM培养液。 1.5 Real-time PCR检测TLR4 mRNA的表达

细胞转染72 h后收集实验组和对照组细胞， 按Trizol试剂说明书的方法提取细胞总RNA。采用 特异性下游引物法将其反转录成cDNA。反转录成 cDNA后，以GAPDH为内参，Real-tine PCR检测 干扰效率，反应条件为95℃预变性30 s、95℃变 性5 s、60℃退火及延34 s、进行45个循环，每个 样品设置3个复孔，在ABI 7500实时定量PCR系统 上进行，实验重复3次。TLR4引物序列^[8]：上游为 5’-CGAGGAAGAGAAGACACCAGT-3’，下游为 5’-CATCATCCTCACTGCTTCTGT-3’。GAPDH序 列^[8]：上游为5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’， 下游为5’-GGAAGATGGTGATGGGATT- 3’。 1.6 流式细胞仪检测细胞表面TLR4蛋白表达

（1）细胞转染72 h后，常规胰酶消化各组细 胞，收集细胞；（2）PBS轻洗细胞2次；（3）加入 小鼠抗人TLR4抗体（1∶250）4℃摇床孵育2 h； （4）PBS轻洗细胞1次；（5）加入FITC标记兔抗 小鼠Ⅱ抗（1:1000）4℃摇床避光孵育1 h；（6） PBS轻洗细胞1次；（7）送检分析，实验重复3次。 1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

（1）细胞转染72 h后，常规胰酶消化各组细 胞，收集细胞；（2）PBS轻洗细胞1次；（3）加 入195 μl Binding Buffer重悬细胞；（4）细胞悬液 中加入5 μl Annexin V-FITC试剂，混匀后4℃避光 孵育20 min；（5）1 000 g离心5 min，小心弃上 清液；（6）加入190 μl Binding Buffer重悬细胞； （7）细胞悬液中加入10 μl PI轻轻混匀，4℃避光 孵育5 min，1 h内送检分析，实验重复3次。 1.8 流式细胞仪检测细胞周期

（1）细胞转染72 h后，常规胰酶消化各组细 胞，收集细胞；（2）PBS轻洗细胞1次；（3）加入1 ml冰浴预冷的70%乙醇，轻轻混匀，4℃固定12~24 h；（4）1000 g离心5 min，小心弃上清液；（5） PBS轻洗细胞1次；（6）加入0.5 ml PI染色液，缓慢 并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30 min；（7） 送检分析，实验重复3次。 1.9 统计学方法

采用SPSS16. 0软件进行独立样本t检验，数据用 （x ±s）表示，P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 TLR4-siRNA下调人肺腺癌A549细胞中TLR4

mRNA和蛋白的表达 Real-time PCR结果显示，转染72 h后，TLR4- siRNA组与NC组相比TLR4 mRNA水平明显下降 （P=0.002），干扰效率达到了70%，见图 1。同时 采用流式细胞仪分析A549细胞表面TLR4蛋白的表 达情况发现，转染72 h后，TLR4-siRNA组检测到 的TLR4蛋白的表达率只有（12.17 ± 1.36）%明显 低于NC组的（27.33 ± 7.86）%（P=0.03），见图 2。可见，本实验设计合成的TLR4-siRNA能够有 效抑制人肺腺癌A549细胞中TLR4 mRNA和蛋白的 表达。

NC: negative control; TLR4:Toll-like receptors 4; **: P<0.01, compared with NC group 图 1 转染72h后A549细胞中TLR4 mRNA的相对表达水平 Figure 1 Expression level of TLR4 mRNA in A549 cells 72h after transfection

图选项

A: NC group; B: TLR4-siRNA group 图 2 转染72h后A549细胞表面TLR4蛋白的表达情况 Figure 2 Expression of TLR4 protein on A549 cells 72h after transfection

图选项

流式细胞仪检测结果显示，转染72 h后，与 NC组相比TLR4-siRNA组A549细胞的凋亡率明 显增加（P=0.002），由（1.73 ± 0.32）%上升至 （7.40 ± 0.75）%，见图 3。可见TLR4表达下调能 够促进人肺腺癌A549细胞的凋亡。

A: NC group; B: TLR4-siRNA group 图 3 转染72h后A549细胞凋亡情况 Figure 3 Apoptosis of A549 cells 72h after transfection

图选项

流式细胞仪检测结果显示，转染72 h 后， 与NC组相比TLR4-siRNA组G₀/G₁期细胞增多， 分别为（48.21 ± 1.15）%与（66.26 ± 2.45）%， （P=0.01），S期细胞明显减少分别为（34.25 ± 1.46）%与（22.63 ± 3.39）%，（P=0.005），而G₂/M 期细胞两组间比较，差异无统计学意义，见图 4。

*: P<0.05,compared with NC group 图 4 转染72h后A549细胞细胞周期分布情况 Figure 4 Cell cycle distribution of A549 cells 72h after transfection

图选项

肺癌是源于支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，发 病率及死亡率高，是世界范围内恶性肿瘤的主要 死因^[9]。研究发现，Toll样受体在多种肿瘤中表达 上调，许多实验证据也表明肿瘤的发展过程可能 与TLR信号转导途径的激活有关，在肿瘤的治疗过 程中值得注意^{[10, 11]}。赵卉等^[12]研究了40例肺癌患者 （其中鳞癌21例、腺癌17例、大细胞癌2例）和40 例癌旁组织中TLR4和TLR9的表达情况，发现肺癌 组织中TLR4和TLR9在mRNA和蛋白水平都有强阳 性表达，且提出TLR4的阳性表达和肺癌的恶性程 度呈正相关。Fu等^[13]采用免疫组织化学方法检测53 例非小细胞癌患者和15例正常肺组织中TLR4蛋白 的表达情况，发现与正常肺组织相比较，TLR4蛋 白的表达水平在非小细胞癌患者的肺组织中显著上 调，TLR4表达与肿瘤分化程度密切相关。

siRNA是近年来新兴的一种在转录后水平高 效特异的沉默基因表达的有效工具，进入哺乳动 物细胞后能够对同源的mRNA产生特异性降解， 作为后基因组时代的一种下调基因表达工具，已广泛应用于基因功能的研究^[8]。在肿瘤的研究方 面，siRNA可明显抑制多种癌基因的表达，使癌 细胞生长受到抑制，并诱导肿瘤细胞凋亡。刘秀 娟等^[14]设计合成了针对TLR4 mRNA的siRNA，发 现其可以有效地抑制缺氧复氧诱导的肾小管上皮 细胞的凋亡和炎性反应。Yang等^[15]也选用siRNA 沉默MDA-MB-231细胞中TLR4的表达后细胞因子 IL-6和IL-8的水平也显著下降，同时抑制了细胞的 增殖能力。Hua等^[16]采用TLR4-siRNA转染高转移 的人前列腺癌PC3细胞，发现TLR4-siRNA能够有 效抑制PC3细胞的迁移和侵袭能力并且促进细胞 的凋亡，裸鼠成瘤实验也证明TLR4-siRNA能够有 效抑制肿瘤的生长。本研究结果显示TLR4-siRNA 组TLR4的mRNA及蛋白表达均明显低于NC组， 证实TLR4-siRNA转染可以从转录及翻译水平有效 抑制A549细胞中TLR4的表达。此外，实验结果还 显示，TLR4-siRNA转染A549细胞后，与NC组相 比，不仅细胞凋亡显著增加，而且出现细胞周期 G₀/G₁期停滞，S期细胞比例明显减少，表明RNA 干扰TLR4表达使A549细胞凋亡增加，且细胞分裂 速度减慢，提示TLR4参与人肺腺癌A549细胞周期 的调控，并与细胞的凋亡有关。肿瘤的恶性增长 与细胞的增殖密切相关，而细胞停滞在G₀/G₁期分 裂速度减慢及凋亡增加将明显降低肿瘤的生长速 度。

综上所述，TLR4-siRNA能有效沉默A549细胞 中TLR4的表达，促进细胞的凋亡并改变细胞周期 的分布从而影响细胞增殖等生物学行为，其可能 的机制仍需要我们进一步探讨研究，以便为肺癌 的治疗提供新的思路。