目前，肺癌的发病率及致死率在所有恶性肿瘤中均居首位^[1]。肺癌的发生、发展是一个多基因、多步骤参与的过程，包括原癌基因活化、抑癌基因的失活等，涉及到生长、侵袭、转移和凋亡等各个阶段^[2,3]。目前，已知与肺癌发生密切相关的基因数目庞大且机制复杂，其中近年发现的一类小分子RNA——微小RNA（microRNA，miRNAs）与肺癌细胞生长、侵袭和凋亡的关系已成为该领域的研究热点之一。

miR-7是近年来报道的miRNAs家族成员之一，在包括肺癌在内的多种临床疾病发生中起重要作用。然而，miR-7在肺癌发生各阶段中的具体作用、机制及其表达的调控机制等仍待研究阐明^[4,5]。我们在前期研究中发现miR-7模拟物（mimics）可显著抑制人肺癌细胞的体外生长和侵袭^[6,7]。此外，我们还成功构建了miR-7的真核表达载体，并观察到过表达miR-7对人肺癌细胞生长和侵袭转移的抑制效应^[8]。因此，在本研究中，我们拟进一步观察过表达miR-7对人肺癌细胞体内外凋亡的作用，以期为miR-7参与肺癌发生、发展过程机制的阐明，以及后续基于miR-7的临床肺癌基因治疗新靶标开发提供前期实验基础。1 材料和方法1.1 细胞株、实验动物及试剂

人源性肺巨细胞癌95D细胞株，购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。DH5α大肠杆菌菌株购于Takara公司。24只雌性BALB/C裸鼠4周龄，体质量10~12 g左右，购自第三军医大学实验动物中心。PCR试剂、Premix Ex Taq Version2.0、RNAisoTMPlus均购自Takara公司；质粒抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司；Lipofectamine^TM 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；细胞培养液RPMI 1640购自Gibco BRL公司；L-谷氨酰胺购自上海政翔化学试剂研究所；双抗（氨卞青霉素钠、硫酸链霉素）购自上海市第四制药股份有限公司；胎牛血清购自Hyclone公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司；0.5%Triton-x-100购自碧云天公司；磷酸化Caspase 3、磷酸化Caspase 9抗体、抗兔-HRP标记和抗兔-FITC标记的二抗均购自Abcom公司。1.2 体外瞬时转染miR-7真核表达载体

将我们前期实验中构建成功的miR-7真核表达载体（命名为p-miR-7）^[9]体外瞬时转染人肺癌95D细胞。具体操作分两部分：（1）细胞培养：用含10%胎牛血清、1 000 u/ml青霉素、100 mg/ml链霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液，于37℃、5%CO₂条件下培养95D细胞，并扩大培养，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数并离心收集细胞，用0.9%氯化钠溶液调整细胞浓度为5×10⁷/ml备用。（2）细胞转染：用胰蛋白酶消化并收集细胞对数生长期的95D细胞，将3×10⁵个细胞重悬于1 ml RPMI 1640培养液中，转移至6孔板，在37℃、5%CO₂条件下培养；12 h后对细胞分别用p-miR-7和p-Cont进行转染。1.3 TUNEL原位凋亡法检测以上各实验组的凋亡情况

收集95D细胞，将其转移至专用细胞培养载玻片中，培养条件和转染方法同前。培养48 h后，取出培养细胞载玻片，吸掉培养液。浸入4%多聚甲醛PBS溶液中，室温固定20 min。于PBS溶液中浸洗30 min。将载玻片浸入封闭液中，室温封闭10 min。PBS漂洗。于通透液（破膜液）中，冰上（2℃~8℃）促渗2 min。PBS漂洗。加100 μl TUNEL reaction mixture 反应液，加盖玻片，置于湿盒中，37℃避光反应60 min。PBS漂洗。DAPI染色3 min。PBS漂洗。滴加pH7.4 50%的缓冲甘油，盖上盖玻片，封片。用激光共聚焦显微镜进行观察，拍片并计算阳性。1.4 免疫荧光技术检测以上各实验组中磷酸化Caspase3、磷酸化Caspase9蛋白的表达

收集95D细胞，将其转移至专用细胞培养载玻片中，培养条件和转染方法同前。培养48 h后，取出培养细胞的玻片，洗掉培养液，用4%多聚甲醛固定20 min，用PBS漂洗。加含10%牛白蛋白的PBS封闭1 h，用PBS漂洗。加0.5% Triton-x-100 PBS进行破膜2 min，PBS漂洗。滴加Caspase3或Caspase9抗体（1∶100），置于4℃湿盒中过夜，取出用PBS漂洗。加入1∶200倍稀释的羊抗兔-FITC二抗，置于37℃湿盒中避光作用1 h，PBS漂洗。滴加DAPI染液，染色3 min，PBS漂洗。滴加pH7.4 50%的缓冲甘油，盖上盖玻片，封片。用激光共聚焦显微镜进行观察，拍片并利用ImagePro Plus软件测量平均荧光强度。1.5 建立裸鼠95D肺癌皮下移植瘤模型

裸鼠购回后于SPF环境下观察饲养1周，在裸鼠右侧腋窝中部外侧皮下接种5×10⁷个95D细胞，编号并随机分为实验组和对照组（每组12只），p-miR-7重组载体及p-Cont局部注射参考前期实验^[9]。接种95D后于第2、3、4、5、6及7周用游标卡尺测量肿瘤大小。并于第7周末麻醉后处死裸鼠，取出皮下肿瘤组织。1.6 肿瘤组织TUNEL原位凋亡检测

常规制作冰冻切片，-80℃中取出冰冻切片室温平衡15 min，置PBS溶液浸泡10 min。浸入4%多聚甲醛PBS溶液中，室温固定20 min。用PBS溶液漂洗。浸入封闭液中，室温封闭10 min。用PBS漂洗。于通透液（破膜液）中，冰上（2℃~8℃）促渗2 min。用PBS漂洗。加50 μl TUNEL reaction mixture反应液，加盖玻片，置于湿盒中，37℃避光反应60 min。用PBS漂洗。滴加DAPI染色3 min。用PBS漂洗。滴加pH7.4 50%的缓冲甘油，盖上盖玻片，封片。用激光共聚焦显微镜进行观察，拍片。1.7 免疫组织化学检测磷酸化Caspase 3、磷酸化Caspase 9蛋白的表达水平

常规制作石蜡切片，-80℃中取出石蜡切片脱蜡至水。3%H₂O₂室温10 min，目的是消除内源性过氧化物酶的活性。微波和柠檬酸盐修复。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。10%正常牛白蛋白（PBS稀释）封闭，室温孵育20 min。倾去血清，勿洗，滴加1∶200倍比例稀释的一抗，4℃过夜。PBS冲洗。滴加适当比例稀释的HRP 标记二抗（PBS稀释），37℃孵育30 min。PBS冲洗。滴加显色剂显色（DAB）。自来水充分冲洗，苏木精对比染色，二甲苯透明后，中性树胶封片后镜检。1.8 统计学方法

所有数据均以（x±s）表示，数据采用SPSS16.0软件分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 瞬时转染p-miR-7对95D细胞凋亡的影响

我们在前期研究中发现，利用构建的真核表达载体（命名为p-miR-7）过表达miR-7可以显著增加人肺癌细胞中miR-7的表达水平，并明显抑制细胞的体外生长^[6,7,8]。为了进一步观察p-miR-7载体过表达miR-7对人肺癌细胞凋亡的影响，我们利用TUNEL实验观察了各组中细胞凋亡水平的变化。结果显示，各组中均存在细胞的凋亡；然而与对照组（p-Cont组30.15±0.35）比较，p-miR-7组（52.34±0.25）细胞的凋亡比例明显增加（P=0.000），见图 1，提示过表达miR-7可导致肺癌细胞的凋亡。

图 1 转染p-miR-7后人肺癌95D细胞凋亡检测（TUNEL ×400） Figure 1 The apoptosis of human lung cancer cell line 95D transiently transfected with p-miR-7(TUNEL ×400)

图选项

结果显示，与p-Cont组相比，p-miR-7组中这两种蛋白的磷酸化水平均显著增加（P=0.000），见表 1、图 2，这与我们前面的结果是一致的。

表 1 Image-Pro Plus(IPP)分析各组95D细胞中p-Caspase3和p-Caspase9的荧光强度（x±s） Table 1 The fluorescence intensity p-Caspase3 and p-Caspase9 in 95D cells in two groups analyzed by ImagePro Plus(IPP)（x±s）

表选项

图 2 免疫荧光法检测肺癌95D细胞中p-Caspase3和p-Caspase9的表达（×400） Figure 2 Immunofluorescence analysis of p-Caspase3 and p-Caspase9 proteins expression in human lung cancer cell line 95D (×400)

图选项

明确利用真核表达载体过表达miR-7对人肺癌细胞凋亡的作用，我们进一步建立了人裸鼠实验动物模型。肿瘤局部注射p-miR-7后，观察了各实验组中肿瘤组织的病理变化。HE染色结果显示：p-Cont对照组细胞形态多样，不规则，可见核质比加大，细胞核呈多形性、染色深，有些可见多个核；而p-miR-7组则可见大片凋亡坏死区域，见图 3。

A:p-Cont; B:p-miR-7; Arrows refers to the necrosis area in lung cancer tissues 图 3 肺癌组织苏木精-伊红染色结果 (×100) Figure 3 Hematoxylin and eosin staining of lung cancer tissues (×100)

图选项

我们进而利用Real-time PCR探针法检测了各组肿瘤组织中miR-7成熟体的相对表达水平。p-miR-7组为（37.06±1.28），p-Cont组为（1.01±0.21）。提示，p-miR-7重组载体可在肿瘤组织中有效表达miR-7。我们进一步利用TUNEL法检测了各实验组中肿瘤局部细胞凋亡的变化。激光共聚焦检测结果显示：p-miR-7实验组（45.35±0.23）与p-Cont对照组（18.33±0.34）相比，肿瘤组织细胞的凋亡明显增加，差异具有统计学意义（P=0.000），见图 4，这也与我们前面部分的实验结果一致。

图 4 TUNEL检测肺癌组织细胞原位凋亡（×400） Figure 4 TUNEL detection of cell apoptosis in lung cancer mass in situ (×400)

图选项

前面的实验结果显示，miR-7过表达可增加凋亡相关分子磷酸化Caspase3和磷酸化Caspase9的水平。为了进一步明确过表达miR-7体内对肿瘤凋亡的作用，我们利用免疫组织化学法检测了各组中相关分子的表达。p-miR-7组与p-Cont组相比，凋亡相关的磷酸化Caspase3和磷酸化Caspase9蛋白水平则显著增加，见图 5。这提示，过表达miR-7可促进肿瘤凋亡相关蛋白的表达。

图 5 肺癌组织中相应蛋白的表达（免疫组织化学 ×200） Figure 5 The expression of corresponding proteins in lung cancer tissues (IHC ×200)

图选项

微小RNA（microRNAs或miRNAs）是一组广泛存在于真核生物中的内源性、非编码、单链小分子RNA，长度在22~24 nt。miRNAs能与目的基因的3′端非翻译区（3′untranslated region,3′UTR）结合，在转录后水平通过促进靶mRNA的降解或抑制蛋白质翻译来负调控目的基因表达，从而参与调控细胞的发育、分化、转移和凋亡^[10,11]。近年来大量的研究显示，多种miRNA的异常表达与肺癌的发生、发展及凋亡密切相关。

miR-7是定位于15号染色体中的mRNA家族成员，其表达变化与多种肿瘤发生及侵袭转移密切相关^[12]。Kefas等^[13]发现，miR-7可以通过抑制胶质瘤细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）受体的表达，从而抑制肿瘤的生长。有研究发现，在相同剂量的表柔比星（epirubicin，EPI）处理下，miR-7模拟物转染组A549和H1299细胞的增殖活力下降，细胞凋亡增加^[14]。本课题组在前期研究中发现，与人正常肺组织相比，miR-7在肺癌中的表达明显降低，且利用miRNA芯片技术检测发现，miR-7在高转移潜能人肺癌95D细胞中的表达水平显著低于低转移潜能的95C细胞，并且miR-7模拟物可以抑制95D细胞的生长、转移和凋亡^[6,7]。本研究中我们进一步发现利用p-miR-7载体体外转染过表达miR-7可导致肺癌95D细胞的凋亡。所以我们推测miR-7可能是人肺癌细胞凋亡中的重要调控分子。大量研究显示，在细胞的凋亡过程中，Caspase3和Caspase9的磷酸化改变具有关键作用^[15]。我们的检测结果也显示，miR-7过表达组人肺癌细胞中磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白水平显著增加。这提示miR-7调控人肺癌细胞的凋亡与Caspase信号途径有关。Xiong等^[16]研究也发现，miR-7能通过调控BCL-2表达来调节人肺癌细胞A549的凋亡。然而，由于目前已报道的miR-7靶分子较多，且涉及到肿瘤细胞的生长、转移等过程^[8,16]，因此，miR-7调控人肺癌细胞凋亡的具体分子机制仍待后续研究阐明。

为了进一步明确过表达miR-7对人肺癌细胞凋亡的作用，且为后续的体内肺癌基因治疗提供基础，我们建立了人肺癌裸鼠实验动物模型，并用各实验组与对照组的肿瘤组织做了HE染色。我们的结果显示，局部注射miR-7真核表达载体可有效表达miR-7。与p-Cont组比较，p-miR-7组裸鼠肿瘤凋亡增加，且荷瘤小鼠生存时间明显延长。更重要的是，我们发现过表达miR-7同样可以显著诱导肿瘤细胞的体内凋亡。与体外结果一致的是，我们通过免疫组织化学法也发现肿瘤局部磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白的水平明显增加。新近的研究发现过表达miR-7可以通过调节TLR9信号途径对人肺癌细胞的生长和转移产生抑制效应^[8]。此外，Xu等^[17]还报道过表达miR-133a可以通过调节靶标MMP-14抑制人肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这些研究结果有力地提示，过表达特定miRNAs分子可能作为今后肺癌相关临床治疗靶标开发的重要手段和策略。

总之，在前期实验基础上，我们本研究中进一步观察到过表达miR-7对人肺癌细胞体内外凋亡的作用，为后续深入阐明miR-7在人肺癌发生发展中的作用及机制，以及肺癌基因治疗靶标开发提供了重要的前期实验依据。