乳腺癌是危害女性健康的常见恶性肿瘤之 一，而浸润性导管癌则是乳腺癌最常见的病理类 型。线粒体DNA（mitochondrial,mtDNA）作为 唯一存在于细胞核外的遗传物质，已被发现与多 种肿瘤的发生、发展有关^[1]。mtDNA ATPase6与 ATPase8是编码呼吸链复合体Ⅴ亚基的基因，即共 同编码ATP合酶（ATP syntherase）的F0部分^[2]。由 于F0对ATP的产生有导向作用，因此研究ATPase6 与ATPase8在乳腺浸润性导管癌组织中的转录水 平，对于了解乳腺癌的发生、发展以及肿瘤细胞 的能量供应方式具有重要的理论意义。本研究采 用RT-PCR法检测25例乳腺浸润性导管癌组织及相 应癌旁组织的mtDNA ATPase6与ATPase8 mRNA， 并结合相关临床病理参数进行分析，旨在探讨 mtDNA ATPase6与ATPase8的变化在浸润性乳腺导 管癌发生、发展中的作用。

收集2005年5月—2010年5月在延边大学附属 医院治疗的25例患者，均经病理诊断为乳腺浸润 性导管癌。患者年龄36~73岁，平均年龄（51.73± 7.54）岁。手术后立即切取部分新鲜癌组织及癌旁 组织（距癌组织边缘＞5 cm，病理排除不典型增 生及原位癌），立即投置于液氮，后转置于-70℃ 冰箱保存备用^[3]。按照WHO国际标准进行TNM临 床分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例，其中有 淋巴结转移15例，无淋巴结转移10例。

总RNA提取及RT-PCR检测：取相互对应的 癌组织及癌旁组织各60~80 mg，组织匀浆后溶于 TRIzol液。氯仿分离蛋白，异丙醇沉淀RNA，并 溶于75%乙醇（无核酸酶）后真空干燥，最后溶 于DEPC处理过的去离子水，-70℃保存。选用 德国Eppendorf公司Mastercycler nexus型PCR仪， 按照美国Promega公司的一步法RT-PCR试剂盒 操作要求进行PCR扩增，引物序列为ATPase6： 5′-ATCTGTTCGCTTCATTCATTGC-3′（正义）， 5′-ATCAGGTTCGTCCTTTAGTGTTG-3′（反 义），654 bp，退火温度60℃；ATPase8：5′-GCGACTTACGTGACCAATCTGTACG- 3′（正义）， 5′-TCAATCCACAGCAGTGGTATAAGCC-3′（反 义），186 bp，退火温度62℃；β-actin：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA- 3′（正义）， 5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′（反义）， 313 bp，退火温度60℃。反应条件为48℃反转录反 应45 min，94℃灭活AWV反转录酶活性及引物变 性2 min，然后94℃ 30 s，退火温度1 min，68℃ 2 min，循环40次，68℃ 7 min，4℃冷却。2%琼脂糖 凝胶电泳检测，以β-actin为参考，Gel Doc XR凝胶 成像分析系统成像分析，计算ATPase6与ATPase8 mRNA的相对含量。

实验数据采用（x±s）表示，应用SPSS17.0 统计学软件处理数据，采用t检验及单因素方差分 析，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 癌组织及癌旁组织mtDNA ATPase6与ATPase8 的转录水平。RT-PCR扩增后，mtDNA ATPase6与 ATPase8 mRNA在癌组织与癌旁组织的相对表达量 的比较结果具有相似性，他们在癌组织均明显高 于癌旁组织（P＜0.01）。结合相关临床病理参数 分析比较癌组织mtDNA ATPase6与ATPase8 mRNA 的相对表达量也具有相似性，表现在淋巴结转移阳 性高于淋巴结转移阴性，两者比较差异有统计学意 义（P＜0.05）；TNM分期Ⅱ期较Ⅰ期高，两者比 较差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅲ期也较Ⅰ期 高，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）；而 TNM分期Ⅱ期与Ⅲ期及年龄分组比较差异无统计 学意义（P＞0.05），见表 1、图 1~2。

表 1 乳腺浸润性导管癌mtDNA ATPase6与ATPase8 mRNA表达与临床病理特征的关系 Table 1 Correlation of mtDNA ATPase6 and ATPase8 mRNA expression to clinicopathological features of breast invasive ductal carcinoma

表选项

P: adjacent normal tissues; n=25; C: breast invasive ductal carcinoma tissue; *: P＜0.01, compared with P 图 1 乳腺浸润性导管癌组织与癌旁组织mtDNA ATPase6 mRNA的表达 (n=25) Figure 1 Comparison of mitochondrial DNA (mtDNA) ATPase6 mRNA expression between breast invasive ductal carcinoma and adjacent normal tissues (n=25)

图选项

*: P＜0.01, compared with P 图 2 乳腺浸润性导管癌组织与癌旁组织mtDNA ATPase8 mRNA的表达 (n=25) Figure 2 Comparison of mtDNA ATPase8 mRNA expression between breast invasive ductal carcinoma and adjacent normal tissues (n=25)

图选项

细胞代谢依赖ATP提供能量，肿瘤细胞也不 例外。细胞产生ATP的方式主要有两种：氧化磷 酸化和糖酵解。其中，氧化磷酸化在正常细胞中 发生；而糖酵解则在肿瘤细胞中发生^[4]。造成这 一结果的原因有很多，包括HIF等相关细胞因子 激活、糖酵解关键酶或载体数量或活性改变、氧 化磷酸化功能损坏等。呼吸链复合体Ⅴ又称ATP 合酶，是氧化磷酸化过程中发挥核心作用的酶， 主要有F0和F1两部分组成。其中，F1具有催化 ATP合成或水解活性的作用，而F0的主要功能则 是构成离子通道，便于质子流通过，对于ATP产 生具有导向作用^[5]。F0的两个主要亚基由mtDNA ATPase6与ATPase8编码。乳腺癌发生过程中， 癌细胞对能量的需求增高，细胞内糖酵解途径增 强。由于肿瘤细胞氧化磷酸化功能损坏，其组成 译均应下调。但本研究发现乳腺癌癌组织mtDNA ATPase6与ATPase8的转录水平较癌旁组织明显增 强。而我们前期研究发现乳腺癌组织mtDNA拷贝 量下降^[6]。mtDNA ATPase6与ATPase8作为mtDNA 的重要组成部分，其转录水平不降反升的现象更 具研究价值。考虑原因可能为：（1）由于F0的 ATP产生的导向作用，在糖酵解产生ATP过程中，F0也发挥着一定的作用，这要求其组成部分的表 达上调；（2）乳腺癌发生、发展需要多种信号通 路及蛋白复合物参与。mtDNA ATPase6与ATPase8 编码蛋白参与了其他蛋白复合物构成，且此种复 合物对乳腺癌发生、发展起到一定作用。这两点 我们将在今后的研究中逐一进行探讨与验证。本 研究还结合相关临床病理参数。患者年龄、淋巴 结转移、TNM分期是常用的乳腺癌临床病理参 数，也是判断乳腺癌转移及预后的重要指标^{[7, 8]}。 通过研究，我们发现有淋巴结转移者较无淋巴 结转移者转录水平增高，表明mtDNA ATPase6与 ATPase8可能参与了乳腺癌的转移，但ATPase6与 ATPase8在转移过程中的具体作用不详。同时我们 还发现TNM分期中mtDNA ATPase6与ATPase8的转 录水平表现为Ⅱ、Ⅲ期较Ⅰ期增高，其中Ⅲ期最 为显著。TNM分期主要反映的是肿瘤大小、淋巴 结转移、远处转移。此项研究结果也验证了我们 的假设。至于mtDNA ATPase6与ATPase8的转录与 肿瘤大小的关联，我们将进行后续研究。综上所 述，我们认为mtDNA ATPase6与ATPase8参与了乳 腺浸润性导管癌的发生，其作用机制可能与能量 供应有关；同时mtDNA ATPase6与ATPase8也参与 了乳腺浸润性导管癌的转移，但其具体作用机制 有待进一步研究。