乳腺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织统计，乳腺癌是女性死亡的首要原因^[1]。手术是目前治疗乳腺癌最有效的手段，然而相当一部分患者诊断时已经处于中晚期，不能通过根治性手术治愈^[2]。虽然曲妥珠单抗的出现对乳腺癌患者的治疗产生了革命性的影响，但是对其HER2阴性的患者无效^{[3, 4]}。因此，进一步阐明乳腺癌的发病机制，寻找新的治疗靶点，对提高乳腺癌的疗效、改善患者的预后具有极其重要的作用。

环氧合酶-2（COX-2）是前列腺素E2（PGE2）合成过程中重要的限速酶^[5]。研究表明PGE2在许多恶性肿瘤组织中表达显著升高，其可以抑制机体的免疫功能，与恶性肿瘤的进展和预后不良关系密切^{[5, 6, 7, 8, 9]}。MicroRNA（miRNA）是一类长度约18~25 nt的非编码内源性小RNA分子，参与调控了人体内约30%编码基因，在多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，研究表明，miR-26a在多种恶性肿瘤中表达异常，而有关其在乳腺癌中的表达和功能的研究，国内外尚未见报道^{[10, 11]}。本研究通过比较正常乳腺细胞和乳腺癌组织及细胞中miR-26a的表达，并通过将miR-26a转染到乳腺癌细胞中，观察过表达miR-26a对乳腺癌细胞增殖侵袭的影响，进而探讨其在乳腺癌发生发展过程中的作用机制。

人乳腺癌细胞株MCF-7、BT474及健康者乳腺细胞MCF-10A购自美国模式培养物集存库（ATCC），保存于本科室。细胞在含10%胎牛血清（美国Gibco公司）的DMEM培养液中，于37℃、含5%CO2的细胞培养箱内传代培养。

选取2014年8月—2015年2月于四川省人民医院行手术治疗的20例经病理确诊为乳腺癌的女性患者手术标本为研究对象。患者年龄34~68岁，中位年龄48岁。选取患者手术标本中乳腺癌组织及相应癌旁组织（距肿瘤组织边缘大于5 cm的正常位乳腺组织），离体10 min内放入液氮保存，供后续实验使用。术前告知患者科研实验的目的和方法，并签署知情同意书。

总RNA提取试剂盒（Total RNA ExtractionReagent,TRIzol）购自深圳达科为生物技术有限公司，RNA反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，Cell Counting Kit（CCK-8）购自江苏碧云天生物技术研究所。

取上述液氮保存的组织样本，研磨后加入1 mlTRIzol。对于传代培养的乳腺癌和正常乳腺细胞株，收集并用PBS洗涤，1 000 r/min离心5 min后，加入1 ml TRIzol。按照miRNA分离提取试剂盒所提供的步骤提取miRNA。用紫外分光光度仪测定所提取RNA的浓度及纯度。

取上述实验中提取的RNA，使用PCR仪将其反转录为cDNA，反应体系见表 1，反应条件为：25℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。

表 1 RNA反转录的反应条件 Table 1 Reaction conditions of RNA reverse transcription

表选项

以cDNA为模板，按照Bi-Rad公司RT-qPCR试剂盒提供的步骤加入相关试剂及引物，以U6为内参，在ABI-7300实时荧光定量仪上进行PCR扩增。反应条件为：95℃ 3min，变性95℃ 12s，退火62℃ 40s，共40个循环。实验结果采用2^-ΔΔCt法进行表达量相对定量分析。

收集细胞样品，将细胞裂解液裂解后的蛋白样品经8% SDS-PAE电泳分离后转移至硝酸纤维素膜（Millipore），与浓度为1:1 000的一抗（COX-2兔单克隆抗体，美国Cell signalling公司）和1:5 000的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（山羊抗兔IgG H&L，英国Abcam公司）孵育后，DAB显色发光。

用Invitrogen公司Lipo2000转染试剂盒所提供的方法，将miR-NC和miR-26a转染至生长对数期的乳腺癌细胞，转染24 h后将细胞正常培养，并于-80℃保存，供后续实验使用。

分别取野生型乳腺癌细胞（A549,BT474）以及转染过空载体（A549/NC,BT474/NC）和miR-26a的乳腺癌细胞（A549/26a,BT474/26a）铺于48孔板，细胞初始密度为每孔3 000个，分别于第1、2、3、4、5 d按照CCK-8试剂盒提供的步骤检测细胞活力并进行统计学分析。

收集对数生长期的乳腺癌细胞，计数后铺于6孔板，细胞密度为每孔100个。将其置于细胞培养箱中正常培养，2周后，当细胞培养板中出现肉眼可见克隆时，终止培养，用PBS小心冲洗2次后，用4%的中性甲醇固定细胞15 min后用瑞氏-吉姆萨复合染色液染色30 min，流水缓慢洗涤后自然空气干燥。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，按照如下公式计算克隆形成率^[12]：克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

采用SPSS11.0软件进行统计学分析，对于两组均数的比较采用非配对t检验进行统计学分析；对于3组和3组以上均数的比较采用单因素方差分析，并以Dunnett t检验进行组间两两比较；对于同一研究对象的某一观察指标在不同时间点进行的多次测量结果（CCK-8检测细胞活力，小鼠皮下肿瘤生长曲线）采用重复测量数据的方差分析进行统计学比较，检验水准α=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。

20例患者乳腺癌组织与癌旁组织中miR-26a相对于管家基因U6的表达量分布见图 1A。乳腺癌组织中miR-26a相对于管家基因U6的表达量为（1.69±0.91），低于癌旁组织中miR-26a的相对表达量（5.31±1.45），差异具有统计学意义（t=20.33,P=0.001），见图 1B。

A-B: miR-26a expression in breast cancer and paracarcinoma tissues; C: miR-26a expression in normal human mammary cell line MCF-10A and breast cancer cells lines MCF-7 and BT474; *: P<0.05; **: P<0.01 图 1 RT-PCR检测miR-26a在乳腺癌组织和 乳腺各组细胞中的表达 Figure 1 miR-26a expression in breast cancer tissues and mammary cells detected by RT-PCR

图选项

乳腺癌细胞系MCF-7和BT474中miR-26a相对于管家基因U6的表达量分别为（1.57±0.46）和（1.26±0.38），低于健康者乳腺细胞系MCF-10A细胞中miR-26a的相对表达量（4.63±0.57），差异具有统计学意义（Dunnett t test I-J=－0.031,P=0.001），而两种乳腺癌细胞系之间，miR-26a的相对表达量差异并无统计学意义（t=1.03,P=0.43），见图 1C 。

Western blot所得的图像用Quality One做灰度扫描后，用COX-2与GAPDH灰度的比值来代表其相对表达量并进行统计学分析，见图 2。结果显示，乳腺癌组织中COX-2的相对表达量为（0.83±0.28），显著高于癌旁组织中COX-2的相对表达量（0.16±0.09）（t=15.60,P=0.011）；乳腺癌细胞系MCF-7、BT474中COX-2的相对表达量分别为（0.94±0.12）和（1.26±0.31），显著高于健康者乳腺系MCF-10A细胞中COX-2的相对表达量（0.10±0.03）（Dunnett t test I-J=－0.028,P=0.000）。

1: Normal tissues; 2: Tumor tissues; 3: MCF-10A; 4: MCF-7; 5: BT-474 图 2 Western blot检测比较乳腺癌组织与癌旁组织以及乳 腺癌细胞（MCF-7, BT474）与健康者乳腺细胞MCF-10A 中COX-2的表达量 Figure 2 Comparison of COX-2 expression in breast cancer tissues, para-carcinoma tissues, breast cancer cell lines(MCF-7, BT474) and normal breast cells MCF-10A detected by Western blot

图选项

Western blot结果表明，在过表达miR-26a后，乳腺癌细胞MCF-7和BT474中COX-2的相对表达量分别从（1.31±0.34）和（1.74±0.52）显著下降至（0.79±0.27）（t=28.47,P=0.002）和（0.52±0.12）（t=22.47,P=0.000），两者的差异具有统计学意义，见图 3。

1: MCF-7; 2: MCF-7/26a; 3: BT-474; 4: BT-474/26a 图 3 Western blot检测过表达miR-26a后乳腺癌细胞内 COX-2相对表达量的变化 Figure 3 Comparison of COX-2 expression in breast cancer lines MCF-7 and BT474 before and after miR-26a transfection detected by Western blot

图选项

经过5天培养后，MCF-7细胞与MCF-7/NC细胞的活力分别为刚接种时细胞活力的（651.53±90.4）%和（679.05±96.33）%，两者差异无统计学意义（F=1.44,P=0.316），见图 4A。而过表达miR-26a的MCF-7/26a细胞活力为刚接种时的（307.34±56.28）%，显著低于MCF-7（F=5.284,P=0.013）和MCF-7/NC（F=5.082,P=0.010）细胞的细胞活力。克隆形成实验结果显示，MCF-7/26a细胞的克隆形成能力[（31.19±7.30）%]较BT474细胞[（69.37±58.21）%]与BT474/NC细胞[（73.40±9.11）%]有较明显的下降（Dunnett t test I-J=－0.21,P=0.037），见图 4B。在另一株乳腺癌细胞系BT474中，本研究得出了类似的结果，见图 4C、4D。

A: the effects of miR-26a overexpression on the proliferation of MCF-7 cells; B: the effects of miR-26a overexpression on the proliferation of BT474 cells; C: the effects of miR-26a overexpression on the clone formation ability of MCF-7 cells in vitro; D: the effects of miR-26a overexpression on the clone formation ability of BT474 cells 图 4 过表达miR-26a对乳腺癌细胞H08910体外增殖和侵袭的影响 Figure 4 Effects of miR-26a overexpression on proliferation and invasion of breast cancer cell line H08910

图选项

miRNA通过碱基互补与靶信使核糖核酸（mRNA）特异性结合，影响mRNA的降解和翻译，从而控制靶基因的表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等生命过程中发挥着重要的作用^[13]。生物信息学研究表明miRNA参与了人体内约30%的编码基因的调控。一个miRNA分子可以调控多种编码基因的表达，而一个编码基因的表达可以被多个miRNA分子调控，由此在体内组成了一个复杂的调控网络^{[10, 11]}。国内外研究显示，恶性肿瘤中存在多种miRNA的表达异常，提示miRNA可以通过调节不同癌基因或抑癌基因的表达，在恶性肿瘤的发生、发展、转移过程中发挥重要作用，因此，探索不同miRNA在恶性肿瘤组织和细胞内的表达和功能，有可能为发现新的有效的恶性肿瘤治疗手段提供新的思路和方法^{[14, 15]}。本研究结果显示，在患者乳腺癌组织内，miR-26a的表达较癌旁组织和正常细胞内显著减少，而COX-2的表达量则显著上升。这与本研究随后在乳腺癌细胞和健康者乳腺细胞中的研究结果相一致。Mets等^{[14, 15]}研究表明miR-26a可以在转录后水平抑制COX-2的表达，提示COX-2可能是miR-26a的重要靶点。生物信息学分析证实，miR-26a有COX-2的结合位点^{[16, 17]}，进一步为COX-2是miR-26a的有效靶点提供理论依据。为证实乳腺癌组织细胞中miR-26a表达量的下调与COX-2表达量的上调之间的关系，本研究用Lipo2000在乳腺癌细胞MCF-7和BT474中分别成功转染miR-26a，并分别比较了过表达miR-26a前后，乳腺癌细胞中COX-2的表达量。研究表明过表达miR-26a的乳腺癌细胞内，COX-2的表达量较野生型乳腺癌细胞有显著上调。

本实验结果显示，过表达miR-26a的乳腺癌细胞，其体外增殖和克隆形成能力较野生型乳腺癌细胞有显著降低。郝世平等^[5]研究表明，环氧合酶2（COX-2）是前列腺素E2（PGE2）合成过程中重要的限速酶，而PGE2在许多恶性肿瘤组织中表达升高，其可以抑制机体的免疫功能，与肿瘤的发生、浸润、转移和预后不良息息相关^{[5, 6, 7, 8, 9]}。Mas-ferrer等^[18]研究表明COX-2在肿瘤组织微血管的形成过程，以及肿瘤细胞凋亡抵制方面发挥着异常重要的作用。本研究发现，在乳腺癌组织和细胞中，miR-26a与COX-2的表达具有明显的负相关关系，且过表达miR-26a后，乳腺癌细胞的体外增殖和克隆形成能力均显著下降。这些结果提示miR-26a很可能是通过调控其靶基因COX-2的表达，从而影响乳腺癌的发生、发展。因此，通过上调乳腺癌组织细胞内miR-26a的表达有可能成为治疗乳腺癌的有效手段。