PPP2R5C是蛋白磷酸酶2A的一个调节亚单位，在调节细胞增殖、转化和凋亡中起重要作用，其表达模式的改变可能与细胞恶性转化有关^{[1, 2, 3]}。PPP2R5C基因定位于14q32.2，在人体中有五种拼接体表达，分别是B56γ1~B56γ6。我们前期研究发现，PPP2R5C在多种白血病细胞中过表达^[4]，而下调PPP2R5C可明显抑制白血病细胞K562和Jurkat细胞的增殖^{[5, 6]}，同时，我们初步发现其抑制作用与TCR、Wnt、Ca²⁺和MAPK等信号通路相关^[6]。本研究进一步分析PPP2R5C-siRNA下调Jurkat细胞PPP2R5C后，与细胞凋亡密切相关的GSK-3β（glycogen synthase kinase 3 beta）、MDM2（Mdm2 p53 binding protein homolog）、pTEN（phosphatase and tensin homolog）和TP53（tumor protein p53）信号通路相关基因的变化情况，进一步明确PPP2R5C在白血病细胞增殖和凋亡中的相关分子机制。

T细胞白血病细胞株Jurkat为本室引进的细胞株，培养条件为：RPMI1640培养液（美国Gibco公司）含有10%胎牛血清（美国HyClone公司），加青霉素（苏州二叶制药有限公司）链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司）双抗培养。培养于5%CO₂、37℃培养箱（美国Thermo公司），2~3天换液传代一次。

实验分组分为siRNA转染组和空白对照NC组。siRNA转染组：收集2.5×10⁶个处于对数生长期的Jurkat细胞，1 100 r/min离心10 min，完全去除上清液；采用核转染试剂盒Suspension cell lines Nucleofector^TM Kit L（德国Amaxa公司）中100 μl预热至室温的Nucleofector^TM溶液和Supplement混合液（9:2，即配即用）悬浮细胞；加入1 μl PPP2R5C-siRNA799（美国Invitrogen公司化学合成，发明专利：ZL201110340411.1），核转染专用的移液管混匀后加入核转杯，启动Nucleofector^TM核酸转染仪（德国Amaxa公司）特异性程序X-001，转染完成后立刻用核转染试剂盒里配套的移液管将转染后的细胞液，接种于含培养液的培养瓶中继续培养48 h。NC组：Jurkat细胞不做处理培养48 h。

应用TRIzol试剂盒提取siRNA转染组和NC对照组Jurkat细胞的总RNA。提取后的RNA在100 V、体积分数为2%的琼脂糖凝胶中进行电泳并初步分析其质量。

Affymetrix基因表达谱芯片采用上海伯豪生物技术有限公司Affymetrix GeneChip Scanner 3000扫描仪扫描得到原始图像数据，并应用GeneSpring GX 11.0软件进行差异表达谱分析，最后用SBC分析系统进一步分析其相关信号通路。

利用核转染技术转导PPP2R5C-siRNA799的Jurkat细胞，经细胞培养后，提取RNA得到siRNA转染组和NC对照组总RNA。所提取的各组样本RNA经Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析仪分析，显示RNA A260/A280均在1.8~2.0之间，RNA分子完整数（RNA integrity number, RIN）值分别为8.9和8.1，且28S/18S分别为1.5和1.2，符合表达谱芯片试验要求（表达谱芯片样本质控要求为RIN≥7.0且28S/18S＞0.7）。

Affymetrix基因表达谱芯片分析显示：经过PPP2R5C-siRNA799处理的Jurkat细胞有963个明显上调（439个）和下调（524个）的基因^[6]。所涉及的信号通路较多，我们前期研究已探讨了下调PPP2R5C后涉及T细胞活化信号通路TCR（T-cell receptor signaling pathway）、Wnt（Wnt/β-catenin signaling pathway）、Ca²⁺（calcium signaling pathway）和MAPK（mitogen-activated protein kinase signaling pathway）信号通路改变情况^[6]。然而，这些变化仍不能完全了解下调PPP2R5C后Jurkat细胞的变化特点。

本研究进一步分析下调PPP2R5对Jurkat细胞中涉及细胞增殖和凋亡GSK-3β、MDM2、pTEN、TP53信号通路相关的47个基因的影响情况。我们发现这4个信号通路中，上调基因有22个，下调基因有25个，其中基因上调、下调倍数小于2倍的分别有16个和24个，大于2倍的分别有6个和1个。上调倍数大于2倍的基因有SNAI1、APC、CDKN1A、ATM、MDM2和pTEN，下调倍数大于2倍的基因只有GSK-3β。MDM2和pTEN基因自身分别上调了16.5倍和2.76倍，GSK-3β和TP53下调2.19倍和1.69倍、其余基因上调、下调倍数均为1倍左右，见图 1。将这些基因的芯片扫描数据均一化后，再经SBC系统分析后得到热图，见图 2。

A: GSK-3β signaling pathway; B: MDM2 signaling pathway; C: pTEN signaling pathway; D: TP53 signaling pathway 图 1 下调PPP2R5C后Jurkat细胞中GSK-3β、MDM2、pTEN、TP53信号通路相关基因表达倍数图 Figure 1 Expression of genes related to GSK-3β, MDM2, pTEN and TP53 signaling pathways after PPP2R5C knockdown in Jurkat cells

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Notes: 0, 1, 2, 3, -1, -2, -3: The Log values of upregulated or downregulated multiples with genes which corresponds to the color represented; NC: Normal Control 图 2 下调PPP2R5C后Jurkat细胞中GSK-3β、MDM2、pTEN、TP53信号通路相关基因改变热图 Figure 2 Expression of genes related to GSK-3β, MDM2, pTEN and TP53 signaling pathway after ppp2r5c knockdown in Jurkat cells analyzed by microarray technology

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GSK-3β（glycogen synthase kinase 3 beta）是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有多种活性调节方式，并参与众多信号转导通路，调节细胞的生长、分化、增殖和凋亡。在肿瘤细胞中，已经证实其主要在癌细胞转录、加速细胞周期、参与肿瘤细胞侵袭与转移及凋亡过程中起到调控作用。TP53（tumor protein p53）又称为p53，作为一个肿瘤抑制基因而广为所知，其介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，活化的p53蛋白通过调控下游基因，诱导细胞周期停滞、细胞凋亡、DNA修复和衰老来抑制肿瘤细胞的恶化^[7]。细胞正常生长情况下p53处于一个低表达水平，它的激活会受到MDM2的活化抑制^[8]。MDM2（murine double minute 2）最初是在转化的成纤维细胞中发现的，编码一种锌指蛋白，可与p53蛋白结合，抑制p53介导的转录活性和阻止p53诱导凋亡的作用，引起肿瘤发生。除此之外，MDM2还可以与p21蛋白结合参与调节细胞增殖和凋亡。下调MDM2表达，p21蛋白表达就相应增加，导致细胞周期阻滞，并提高肿瘤细胞的化学敏感度^[9]。pTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）是一种抑癌基因，在细胞生长、凋亡、黏附、迁移、浸润等方面具有重要作用^[10]。据以往文献报道^{[8, 9, 10, 11, 12]}，与GSK-3β、MDM2、pTEN和TP53相关的基因众多，其中MDM2、CDKN1A、TP53和ATM与4个通路均相关，基于上述几个信号通路在细胞增殖和凋亡中的作用，本研究进一步从下调PPP2R5C表达后Jurkat细胞表达谱基因芯片结果中分析GSK-3β、MDM2、pTEN和TP53相关基因表达谱特点，非常明显的变化是下调PPP2R5C表达后，Jurkat细胞中涉及GSK-3β、MDM2、pTEN和TP53相关的全部47基因表达水平均发现变化，超过2倍上、下调基因有SNAI1、APC、CDKN1A、ATM、MDM2、pTEN和GSK-3β等7个基因。提示在下调PPP2R5C时，对Jurkat细胞中上述通路基因的影响存在一定的选择性，同时也提示这些基因的上调、下调参与了与调控PPP2R5C相关的细胞增殖抑制。下调PPP2R5C后，MDM2明显上调（16.5倍），而P53下调（1.69倍）处于一个低表达水平，细胞增殖得到抑制，这反向验证了MDM2抑制剂可以有效的提高P53活化水平和细胞凋亡率^[11]，同时也一定程度验证了PPP2R5C主要是通 过介导P53蛋白上的变化而发挥作用的^{[2, 12]}。本结果初步提示下调PPP2R5C基因可能通过MDM2和P53基因来调控影响肿瘤细胞相应的信号通路，从而起到抑制细胞增殖和凋亡的作用，使细胞回到正常的生长状态，还有待进一步的验证。下调PPP2R5C后，ATM明显上调（2.74倍），TP53下调（1.69倍），这一定程度上反向验证了DNA损伤后，ATM磷酸化可以定向调节PPP2R5C表达，而PPP2R5C磷酸化又可以激活P53的肿瘤抑制功能^[13]。SNAI1是一个转录调节因子，上调了2.0 7倍；CDKN1A是细胞周期抑制因子，上调了2.41倍，而CDKN1A基因又是SNAI1蛋白的抑制靶点^[14]，提示下调PPP2R5C基因可能主要在转录水平促进一些细胞周期抑制基因的转录、表达来抑制细胞的增殖。CDKN1A基因编码P21蛋白^[12]，P53下调，CDKN1A（P21）上调，细胞增殖受到抑制，这结果正好与文献报道的P53蛋白Thr55发生去磷酸化会促进P21的表达，从而抑制细胞增殖和转化相一致^[15]。综上所述，下调Jurkat细胞PPP2R5C基因可以一定程度抑制TP53基因的功能，并同时促进其相关的CDKN1A和MDM2这些基因的协同作用，可能是发挥抑制Jurkat细胞增殖的效应所在。本研究结果主要在于首先提供了在白血病T细胞中PPP2R5C与GSK-3β、MDM2、pTEN和TP53信号通路之间的相关性，后续研究将挑选其他细胞株对这一结论做进一步的论证工作，也为发现协同靶向抑制T细胞肿瘤提供更系统资料。