大肠癌的发病率居全国恶性肿瘤第4位，其死 亡率居全部恶性肿瘤死亡率的第3位，且其发病率 每年以4.7%逐年递增^[1]。流行病学资料发现，肥 胖与结肠癌的发病密切相关。近年来针对肥胖的 研究发现了一种类似细胞因子的蛋白类激素—瘦 素，其与其靶向瘦素受体结合发挥其生理作用。 瘦素及瘦素受体在多种肿瘤组织中均有表达，并且 对肿瘤细胞的增殖和生长具有促进作用^{[2, 3, 4, 5, 6, 7]}，但其 在结肠癌发生过程中的表达情况及其作用机制目前 尚未完全阐明。本研究采用流式细胞仪检测结肠癌 细胞中瘦素和瘦素受体的表达情况，采用MTT法 及流式细胞仪检测外源性瘦素对结肠癌细胞增殖、 凋亡及细胞周期的影响，旨在探讨瘦素在结肠癌发 生、发展过程中发挥的生物学效应。 1 资料与方法 1.1 资料与试剂

收集广州军区武汉总医院2010年3月至2013年 6月间手术切除经病理证实、术前均未行放化疗或 免疫等治疗的结肠癌患者94例，其中男52例、女42 例，年龄21~84岁，平均年龄（58.3±14）岁。根据 2004年WHO肿瘤组织学分类：高分化26例、中分化 33例、低分化35例。淋巴结转移者54例，远处转移 者25例。Ⅰ期10例、Ⅱ期28例、Ⅲ期31例、Ⅳ期25 例。将同期获得的20例术后正常肠黏膜组织作为对 照。人结肠癌细胞株HT-29由武汉大学提供，瘦素 羊抗人抗体及瘦素受体羊抗人抗体购自美国Santa Cruce公司，胰蛋白酶、瘦素、EDTA均购自美国 Sigma公司，流式细胞仪为德国Miltenyi公司产品。 1.2 检测瘦素及瘦素受体在结肠癌组织中的表达

术中取出的新鲜结肠癌组织切取癌细胞生长 旺盛的边缘处1.5 cm×1.5 cm组织块，放入含有青、 链霉素双抗液中（青霉素含量为10 000 u/ml，链霉 素含量为10 mg/ml）制成单细胞悬液，取0.5 ml细 胞悬液，PBS洗涤、离心、弃上清液，加入羊抗 人瘦素荧光抗体，对照管中加入PBS液，4℃孵育 30 min后洗涤、离心上机检测。每例标本检测1×106 个细胞。瘦素（瘦素受体）阳性率（%）=（试管中 瘦素阳性细胞数－阴性对照阳性细胞数）/10 000× 100%。每例检测三个复测管，取其均值。 1.3 瘦素结肠癌细胞株HT-29细胞增殖的影响

HT-29细胞复苏后培养于10%RPMI 1640培养 液，37℃、20%CO2环境下常规培养，取生长状态 良好的对数期细胞进行试验。将细胞浓度调至5× 10¹²/L，以每孔3 000个细胞接种至96孔板，另取一 孔不含细胞的培养液作空白对照。37℃、5%CO2培 养箱中培养24 h后，各孔加入浓度为0、5、50、100 和200 ng/ml的瘦素，对应分为5组（0、5、50、100 和200 ng/ml），每组3个复孔，分别培养24、48和 72 h后，每孔加入0.5%MTT 200 μl后连续培养4 h， 吸尽混合培养液，加入DMSO 200 μl振荡15 min后 用酶标仪于495 nm波长下检测每孔的OD值。细胞 生长率（%）=A_{实验组平均值}/A_{对照组平均值}×100%。 1.4 瘦素对HT-29细胞周期及凋亡的影响

结肠癌细胞株HT-29细胞按接种传代原则接种 到培养瓶稳定传代后，实验组加入终浓度为5、50、 100和200 ng/ml的瘦素，不加药物的空白瓶为对照 组。培养24、48和72 h后加入0.25%的胰消化酶制成 单细胞悬液，1 000 r/min离心，弃上清液后用buffer 重悬，加入PI染色液1.0 ml，30 min后上机检测。应用DNA细胞周期分布软件计算DNA直方图各时相 分布百分比，细胞周期为G₀/G₁、S和G₂/M期，各期 细胞百分率=本期细胞数/细胞总数×100%，细胞增 殖指数=S+G₂/M期细胞数/细胞总数×100%。 1.5 统计学方法

所有数据以均数标±准差（x±s）表示，采用 SPSS13.0统计软件对相关数据进行t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 瘦素及瘦素受体在结肠癌组织中的表达

瘦素在结肠癌组织和正常结肠组织中的阳 性表达率分别为：（80.3±1.83）%和（59.83± 1.12）%，差异有统计学意义（P<0.01）；瘦素受 体在结肠癌及正常结肠组织中的阳性表达率分别 为（82.14±1.63）%和（65.21±1.45）%，差异有统 计学意义（P<0.05）。 2.2 瘦素和瘦素受体在结肠癌组织中的表达与结肠癌临床病理关系

瘦素和瘦素受体在结肠癌组织中的表达 与结肠癌患者的性别、年龄、分化程度、淋巴 结或远处转移及临床分期无明显相关性（P＞ 0.05），见表 1。

表 1 瘦素和瘦素受体的表达与结肠癌临床病理学特征的关系 (x±s) Table 1 Relationship between the expression of leptin,its receptor and clinicopathological characteristics of patients with colon cancer (x±s)

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浓度为50、100和200 ng/ml的外源性瘦素作用 TH-29细胞后均明显促进其增殖，随着作用时间的 增加，其促进增殖作用越明显，差异有统计学意 义（P<0.05）；浓度为200 ng/ml的外源性瘦素作用 72 h其促进细胞增殖效应最明显，见图 1、表 2。

图 1 外源性瘦素对TH-29细胞增殖的影响 Figure 1 Effect of exogenous leptin on proliferation of TH-29 cells

图选项

表 2 MTT法观察外源性瘦素对TH-29细胞增殖的影响 Table 2 Effect of exogenous leptin on proliferation of TH-29 cells detected by MTT

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不同浓度外源性瘦素作用TH-29细胞72 h后， 具有明显促进其增殖的作用（P<0.05），但对 TH-29细胞凋亡无明显影响（P＞0.05）；G0/G1 期细胞比例减少，S 期、G2/M期细胞比例增加 （P<0.05），见图 2、表 3。

A: leptin 0ng/ml; B: leptin 5ng/ml; C: leptin 50ng/ml; D: leptin 100ng/ml; E: leptin 200ng/ml 图 2 不同浓度瘦素对TH-29细胞周期及凋亡的影响 Figure 2 Effect of different concentration of leptin on cell cycle and apoptosis of TH-29 cells

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表 3 不同浓度瘦素对TH-29细胞周期及凋亡的影响 Table 3 Effect of different concentration of leptin on cell cycle and apoptosis of TH-29 cells

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瘦素与其瘦素受体在多种肿瘤细胞中均有 表达，其可以调控JAK/STAT(signal transducer and activator of transcription)、MAPK (mitogenactivated protein kinase)、 PI3K/AKT等多种信号 通路，对肿瘤细胞的增殖和生长具有促进作用， 且可调节肿瘤血管生成、转移、化疗耐药等^{[8, 9]}。 本实验发现瘦素和瘦素受体在结肠癌组织中的表 达明显高于正常肠黏膜组织，提示瘦素及瘦素受 体可能参与了结肠癌的发生。Chen等^[10]实验发现 血清中瘦素水平与结肠癌之间并没有相关性，提 示肠道局部分泌的瘦素参与调控了结肠癌的发生 过程。本实验还发现瘦素和瘦素受体在结肠癌组 织中的表达与结肠癌患者的性别、年龄、分化程 度、淋巴结或远处转移及临床分期无明显相关性 （P<0.05），提示瘦素和瘦素受体参与调控结肠 癌的发生是早期过程，其在结肠癌发生的早期发 挥着重要作用。Dubois等^[11]发现外源性瘦素可以促 进乳腺癌细胞的增殖，却不影响正常乳腺细胞的 增殖，说明瘦素不是肿瘤发生的启动因素，而是促进因素。Yoon等^[12]发现结肠癌细胞系中瘦素的 表达与结肠癌的进展相关，外源性瘦素可通过JAK 和ERK信号通路增强结肠癌细胞黏附和侵袭，这 说明瘦素可促进结肠癌的侵袭与转移，瘦素的表 达可能与结肠癌的淋巴结或远处转移相关。Wang 等^[13]发现瘦素在结肠癌组织中的表达与结肠癌肿 瘤分化、淋巴结或远处转移及临床分期相关，与 我们的实践结果不一致，说明瘦素在结肠癌发生 发展中作用尚需进一步研究。

肿瘤的发生过程中细胞增殖和凋亡的失衡是 重要机制。本实验通过MTT法发现浓度为50、100 和200 ng/ml的外源性瘦素作用TH-29细胞后均明显 促进其增殖，随着作用时间的增加，其促进增殖 作用越明显，浓度为200 ng/ml的外源性瘦素作用 72 h其促进细胞增殖效应最明显。细胞的增殖改 变与细胞周期的改变密切相关，S期最能反应细胞 的增殖活性，本实验通过流式细胞分析仪发现， 不同浓度的外源性瘦素作用TH-29细胞72 h后，明 显具有促进其增殖的作用，但对TH-29细胞的凋亡 无明显影响；G₀/G₁期间细胞比例减少，S期间、 G₂/M期细胞比例增加。本实验提示瘦素可以明显 促进结肠癌细胞的增殖，细胞增殖的增加，而细 胞凋亡无明显改变。目前关于瘦素与细胞凋亡的 关系存在不一致的实验数据。Mokrowiecka等^[14]发 现外源性瘦素可促进食管腺癌细胞株的增殖，但 对其细胞凋亡无明显影响，与我们在结肠癌的数 据一致。而Beales等^[15]却发现外源性瘦素不仅可 以促进食管癌细胞的增殖，还可以明显抑制其凋 亡。同样，Ptak等^[16]发现外源性瘦素同样通过增加 细胞增殖、抑制凋亡的方式促进卵巢癌的发生、 发展。但这些研究都说明外源性瘦素导致了细胞 增殖与凋亡的失衡，这种增殖与凋亡的失衡或许 是瘦素促进结肠癌发生的可能机制。

综上所述，瘦素和瘦素受体可能通过促进细胞 增殖的方式在结肠癌发生过程中发挥重要作用。