胃癌是全球和我国的第二癌症杀手^{[1, 2]}。约 6.2%的胃癌患者表现出恶性腹水，中位生存时间 仅4.9月^[3]。腹腔内灌注化疗药物（如顺铂、5-Fu） 是治疗恶性腹水的主要手段之一，报道有效率在 50%左右^[4]。我们的体外实验证实，顺铂能诱导胃 癌SGC7901细胞发生保护性自噬，氯喹抑制自噬可 以降低Bcl-2的表达，从而增强顺铂的抗癌能力^[5]。 本研究入组了35例接受顺铂腹腔内化疗的胃癌恶 性腹水患者，旨在探讨腹水脱落癌细胞自噬相关基 因Beclin-1 mRNA水平变化与化疗疗效间的关系。 1 资料与方法 1.1 研究对象

收集江西省肿瘤医院2012年1月至2013年6月收治的胃癌恶性腹水患者35例，其中男22例，女 13例；中位年龄53岁（24~71岁）；患者均经病理 组织学确诊为胃腺癌，腹水脱落细胞学找见癌细 胞；ECOG行为评分≥3分，预计生存时间>1月；1 月内未接受化疗；无腹腔灌注化疗禁忌证。 1.2 腹腔化疗方法

患者经床边B型超声定位腹水，行常规腹膜腔穿 刺，置双腔中心静脉导管。闭式引流干净腹水后， 往腹腔内注入0.9%氯化钠溶液250 ml+顺铂60 mg， 地塞米松5 mg；嘱患者定期翻身，每15 min变换1次 体位，必要时每周重复给药1次。 1.3 腹腔化疗疗效判定

通过B型超声检查计算腹水量，按照WHO评 价标准评定疗效。完全缓解（CR）：腹水完全消 失，并持续4周以上；部分缓解（PR）：恶性腹水 减少≥50%且持续4周以上；稳定（SD）：腹水减 少<50%或腹水无变化；进展（PD）：腹水在1月 内恢复原状或较治疗前增加。根据疗效将患者分 成有效组（objective response,OR）和无效组（no response，NR），OR=CR+PR，NR=SD+PD。 1.4 RNA提取及RT-PCR

收集患者腹腔化疗前和首次化疗后第5天的 腹水各20 ml，参照Wang等^[6]报道的方法从腹水中 分离脱落癌细胞。按试剂盒说明书步骤提取RNA 进行RT-PCR。以GAPDH为内参，Beclin-1引物序 列：5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3′ （上游），5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG -3′（下游），Bcl-2基因引物系列分别为： 5'-CG ACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3'（上游）， 5'-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3'（下 游）。将RT-PCR产物进行琼脂凝胶电泳。应用 Gel-Pro3.2软件分析PCR电泳图像，化疗后灰度值 比值降低≥10%定义为mRNA水平发生下降。 1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分 析。两组间计数资料采用卡方检验。两组间比 较，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 患者客观疗效

35例患者均可评价疗效，完成顺铂腹腔内化 疗中位次数3次（2~5），其中完全缓解2例，部分 缓解17例，疾病稳定10例，病情进展6例，化疗有 效率为54.3%（19/35）。 2.2 腹水脱落癌细胞Beclin-1 mRNA变化预测化疗疗效结果

在治疗有效的19例患者中，通过RT-PCR技 术检测到：与治疗前相比，腹腔化疗后第5天腹 水Beclin-1 mRNA水平下降者13例，升高或稳定 者6例；16例治疗无效（NR）的患者中，Beclin-1 mRNA水平出现下降者仅2例，升高或稳定者达14 例，两组卡方检验值χ²=11.091，P=0.001，差异有 统计学意义，见图 1、表 1。此外，Beclin-1 mRNA 下降预测化疗有效的敏感度为86.7%，特异性为 70%。

1: OR; 2: NR; A: before IC; B: 5 days after IC;IC: introperitoneal chemotherapy; OR: objective response; NR: no response 图 1 RT-PCR检测胃癌患者腹水脱落癌细胞Beclin-1和BCL-2 mRNA的表达 Figure 1 Expression of Beclin-1 and BCL-2 mRNA in exfoliative cancer cells before and after IC detected by RT-PCR

图选项

表 1 两组胃癌患者腹水脱落癌细胞Beclin-1 mRNA的变化 Table 1 Changes of Beclin-1 mRNA expression in exfoliative cancer cells between two groups

表选项

顺铂腹腔内灌注化疗有效的患者，通过RTPCR 检测到腹水脱落癌细胞Bcl-2 mRNA表达下 降，而治疗无效的患者表现为Bcl-2 mRNA水平升 高，见图 1。提示顺铂可能通过抑制Bcl-2活性来发 挥抗癌作用。 3 讨论

恶性腹水是肿瘤患者进入终末期的表现，生存 时间较短，生活质量严重下降^{[7, 8]}。据文献报道， 18.3%的恶性腹水与胃癌有关，且预后较其他原发 肿瘤（如卵巢癌和乳腺癌）更差^[7]。腹腔内灌注顺 铂是临床治疗恶性腹水的常见手段。本研究采用 这一方法治疗胃癌恶性腹水35例，53.4%患者获得 完全缓解或部分缓解，有效率与文献报道相似^[9]。

目前认为，化疗药物是通过诱导细胞凋亡来 杀伤肿瘤细胞的，自噬则是细胞的一种防御和保护机制^[10]。诸多研究已经证实，化疗药物可以诱导肿 瘤细胞产生自噬，导致耐药^{[11, 12]}。Huang等^[11]在骨 肉瘤的研究发现，顺铂作用于骨肉瘤细胞时，会导 致细胞质HMGB1含量增加，继而与自噬调控基因 Beclin-1相结合，启动自噬，从而诱发耐药的产生。

Beclin-1是酵母ATG6基因在哺乳动物中的同源 物，也是第一个被确定的能诱导哺乳动物发生自 噬的蛋白^[13]。Beclin-1常被用作自噬的标志物，可 用于判断自噬活性的强弱，其表达水平越高，细 胞自噬活性越强^[14]。Beclin-1有4个重要的结构域 （与Bcl-2结合的结构域、螺旋结构域、进化保守 结构域和核输出结构域）。Beclin-1并不对自噬的 调节直接发挥作用，而是为凋亡抑制蛋白Bcl-2和 UVRAG（ultraviolet-radiation-resistance-associated gene）蛋白产物等提供一个“平台”，使其在结合到 Beclin-1上后发挥对自噬的调控作用^{[15, 16]}。

本研究结果显示治疗有效组和无效组间 Beclin-1 mRNA的变化趋势存在明显的差别 （P=0.001）。在治疗有效者中，68.4%的患者化 疗后第5天Beclin-1 mRNA水平出现下降，提示自 噬活性减弱。与Bcl-2 mRNA检测结果一起分析， 发现在治疗有效组患者Bcl-2 mRNA和Beclin-1 mRNA表达均较低，即以细胞凋亡为主，而治疗无 效组患者Bcl-2 mRNA和Beclin-1 mRNA表达水平均 较高，即以细胞自噬为主，这与O'Donovan等^[17]报 道相一致。他们将顺铂作用于食管癌细胞，观察 到敏感株以细胞凋亡为主，而耐药株更多地表现 为细胞自噬，采用siRNA技术沉默耐药株Beclin-1 基因后，顺铂的杀伤作用明显增强。

在本研究中，我们通过统计学方法得出腹 水Beclin-1 mRNA下降预测化疗有效的敏感度达 86.7%，特异性为70.0%；此外，我们前期进行的 单因素分析得到顺铂的给药次数（≤3 vs.>3）不是 影响化疗疗效的因素（P>0.05），而与细胞的内 在特性有关（如：Beclin-1），这与Liu等^[18]的研究 结果相仿，他们通过多因素分析得到恶性腹水来 源、两周期治疗后CA125和CEA的变化等是影响 腹膜转移瘤患者预后的独立因素，而与腹腔化疗 周期无关。因此，在腹腔灌注化疗前和化疗后第5 天检测腹水Beclin-1 mRNA水平，有助于早期及时 预测化疗有效。

综上所述，细胞自噬激活可能是顺铂腹腔灌 注治疗恶性腹水失败的机制，脱落癌细胞Beclin-1 mRNA变化在预测顺铂腹腔灌注治疗胃癌恶性腹 水疗效中具有一定的价值，值得进一步研究。