卵巢癌（ovarian cancer）是常见的女性生殖 系统恶性肿瘤之一，虽然其发病率低于宫颈癌和 子宫内膜癌，但是由于其发病隐匿，缺乏早期症 状和有效的筛查手段，导致大多数发现时已经处于疾病中晚期，再加上原发或继发的多药耐药存 在，使其死亡率居妇科恶性肿瘤首位^[1] 。

在内质网中，分泌性蛋白、跨膜蛋白和内质 网驻留蛋白折叠成天然构象，经过修饰后，形成 有活性的功能性蛋白质。如果蛋白质在内质网内 的折叠受到抑制，造成未折叠蛋白聚集，将引起 内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）, 激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR），使蛋白质的生物合成减少，内质网的降解 功能增强，从而降低内质网负担，维持细胞内的 稳态。如果内质网应激持续存在，则可诱发细胞 凋亡^[2]。本实验通过改变卵巢癌耐药细胞株SKOV3 的ERS功能状态进行比较其对顺铂敏感度的差异。 1 资料与方法 1.1 资料

于2012年10月—2013年10月收集武汉华中 科技大学同济医学院附属同济医院卵巢癌患 者腹水5 例，卵巢癌患者在术后病检均得到证 实。卵巢癌细胞系SKOV3 购自美国标准生物 品收藏中心（ATCC）。McCoy′s 5A培养液及 胎牛血清购自美国Gibco公司。顺铂、毒胡萝 卜素（thapsigargin，TG）和牛磺熊去氧胆酸钠 （tauroursodeoxycholate，TUDCA）购于美国Sigma 公司。内质网示踪染料（ER-tracker）购于中国 Beyotime公司。CHOP抗体、GRP78抗体、Cleaveparp 抗体、Cleave-caspase3抗体均购于美国Santa Cruz公司。CHOP、GRP78、GRP94、EIF-2a、 PERK及ATF6引物合成均购于上海生工生物技术有 限公司，增强化学发光（ECL）底物为美国Pierce 公司产品。EPCAM-FITC购于德国Miltenyi公司， 流式凋亡试剂盒购于北京四正柏生物科技有限公 司，羊抗兔、羊抗鼠酶标二抗购于武汉三鹰公司。 1.2 细胞培养

SKOV3细胞用含10%胎牛血清McCoy’s 5A培养液 （含青霉素100 u/ml及链霉素100 μg/ml），在37℃、5% CO₂条件下传代培养。采用0.4%胰酶消化传代培养。 1.3 流式细胞技术凋亡检测

胰酶轻消化收集不同处理因素处理过后的细 胞，离心沉淀细胞弃上清液，用预冷PBS洗2遍 后，每个样品用100 μl 1 × Binding Buffer/PBS重 悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI试剂， 轻轻混匀，4℃避光放置30 min。用流式细胞仪检 测，并采用分析软件进行分析。 1.4 qRT-PCR检测内质网应激相关基因表达

胰酶消化收集不同处理因素处理过后的细胞， 离心沉淀细胞弃上清液，细胞提取2 μg RNA，反 转录合成cDNA第一链，以PCR引物和第一链为模 板，反应条件：95℃ 3 min变性，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40次循环，以β-actin为内参照，进行实时定 量PCR反应并进行数据分析。 1.5 Western blot检测内质网应激相关蛋白表达

胰酶消化收集不同处理因素处理过后的细胞， PBS洗涤。RiPA蛋白裂解液提取收集细胞蛋白，每孔 50 μg上样量进行SDS-PAGE电泳，低温湿转至PVDF 膜上，5%BSA封闭1 h，一抗4℃孵育过夜（CHOP 1∶ 200，GRP78 1∶1 000，GRP94 1∶1 000，P-EIF-2a 1∶1 000，PERK 1∶1 000,GAPDH 1∶2 000）。TBST洗 膜后，加入HRP标记二抗（1∶3 000），室温孵育1 h， TBST充分洗掉背景后用增强ECL底物曝光。 1.6 细胞内质网荧光标记

去除细胞培养液，用适量的含有Ca²⁺和Mg²⁺ 的HBSS溶液洗涤细胞，去除洗涤液，加入37℃ 预温育的ER-Tracker Red染色工作液（取少量ERTracker Red按照1∶1 000加入到ER-Tracker稀释 液中），与细胞37℃共孵育15~30 min。去除ERTracker Red染色工作液，用细胞培养液洗涤细胞 1~2次，随后用激光共聚焦显微镜观察并拍照。 1.7 腹水中卵巢癌细胞分离及鉴定

收集卵巢癌患者腹水，50 ml离心管分装并离 心，1 200 r/min，5 min，离心后弃上清液，红细胞裂 解液重悬细胞作用8 min，PBS终止裂解红细胞，1 200 r/min,5 min，离心后弃上清液，PBS重悬细胞， 1 200 r/min ,5 min，弃上清液，含10%胎牛血清的 McCoy′s 5A培养液重悬细胞种于培养瓶中，在37℃、 5%CO₂条件下培养，24 h后换液，以后每三天换液一 次，直至细胞密度达到95%以上后传代。并采用梯度 消化方法提高卵巢癌细胞纯度，并用流式细胞学技 术单标EPCAM-FITC抗体对其纯度进行鉴定。 1.8 统计学方法

每次试验至少重复三次，应用SPSS 13.0软件 进行统计分析，计量资料以（x±s）表示,两组间比 较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 DDP在卵巢癌耐药细胞株SKOV3中引起ERS

DDP 40 μmol/L处理SKOV3细胞（DDP处理组） 24 h后，进行qRT-PCR检测结果为：DDP处理组ERS 相关基因表达量较未做任何处理者（对照组）明显增 高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 1A；内质网示踪染料（ER-tracker）检测细胞内质网形态，DDP处 理组较对照组明显颗粒化，见图 1B。

ERS: endoplasmic reticulum status;DDP: cisplatin; ERS related proteins: GRP78,GRP94,CHOP,PERK,EIF-2-a and ATF6; *: P＜0.05; A: the alteration of ERS-related genes expression examined by qRTPCR; B: the morphological change observed by ER-tracker 图 1 DDP在卵巢癌细胞中引起内质网应激 Figure 1 ERS elicited by DDP in ovarian cancer cells SKOV3

图选项

TG预处理SKOV3细胞12 h联合DDP作用于 SKOV3细胞24 h（TG联合DDP组），进行后续试 验，流式细胞技术检测其凋亡率，结果显示：TG 联合DDP处理后，其凋亡率明显高于DDP处理组 和对照组，差异有统计学意义（P=0.002）,见图 2A；Western blot结果为：ERS相关蛋白GRP78和 CHOP表达量在TG联合DDP处理组明显高于DDP 处理组和对照组，DDP处理组高于对照组，差异 有统计学意义（P＜0.05），见图 2B。

TG: ERS sensitizer; GAPDH: internal reference; *: P＜0.05 A: the change of apoptosis rate; B: the alteration of ERS related genes 图 2 ERS诱导剂TG对SKOV3细胞DDP敏感度的影响 Figure 2 Effect of TG on the sensitivity of SKOV3 cells to DDP

图选项

TUDCA 250 nM作用于SKOV3 12 h后给予DDP 40 μmol/L处理细胞（TUDCA联合DDP组）24 h， 进行后续试验，流式细胞技术检测其凋亡率，结 果显示：TUDCA联合DDP处理后其凋亡率明显低 于DDP处理组，差异有统计学意义（P=0.001）， 见图 3A；Western blot结果为：ERS相关蛋白表达 量在TUDCA联合DDP组明显低于DDP处理组， DDP处理组高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图 3B。

TUDCA: ERS stabilizer; *: P＜0.05; A: the change of apoptosis rate; B: the alteration of ERS related genes 图 3 ERS稳定剂TUDCA对SKOV3细胞DDP敏感度的影响 Figure 3 Effect of TUDCA on the sensitivity of SKOV3 cells to DDP

图选项

腹水中原代卵巢癌细胞贴壁1周后形态图，见 图 4A；流式细胞术鉴定EPCAM-FITC阳性比例为98.1%，见图 4B；流式细胞术比较TUDCA及TG预 处理对原代卵巢癌细胞DDP敏感度影响结果为： TG可上调DDP引发的凋亡率，TUDCA可降低其凋 亡率，见图 4C；Western blot结果显示TG联合DDP 作用于原代卵巢癌细胞后上调凋亡相关蛋白的表 达，TUDCA反之，见图 4D。

Apoptosis-related protein: Cleaved-parp and Cleaved-caspase-3; *: P<0.05,compared with DDP group; A: morphological figure of the primary ovarian cancer cells in ascites; B: the positive rate of EPCAMFITC checked by flow cytometry; C: effect of TG and TUDCA on the relative apoptosis rate of primary ovarian cancer cells; D: the apoptosis protein detected by Western blot after TG and TUDCA treatment 图 4 改变原代卵巢癌细胞中ERS效应后凋亡相关蛋白的变化 Figure 4 The change of apoptosis-related protein induced by altering ERS in primary ovarian cancer cells

图选项

铂类在过去的几十年已经广泛应用于头颈部 肿瘤、睾丸癌、生殖细胞肿瘤和复发淋巴瘤等多 种肿瘤^[3]。目前顺铂耐药的机制还不是很清楚,但 是已明确涉及到多方面因素:（1）增强解毒性； （2）调节转运蛋白的表达；（3）细胞通过阻碍 顺铂与DNA结合；（4）提高DNA的修复；（5） 激活促细胞存活的基因，如Bcl-2等^{[4, 5]}。

研究表明，许多病理和生理情况，如缺氧、氧化损伤、内质网Ca²⁺耗竭、病毒感染、低血糖、高 脂饮食等均可能导致内质网蛋白折叠负荷能力的失 衡，导致未折叠蛋白在内质网内的堆积，即发生内 质网应激^[6]。在肿瘤发生发展过程中，由于肿瘤细 胞的快速增长、代谢旺盛对能量需求增加以及血液 供应相对不足，肿瘤细胞处于氧和葡萄糖相对缺乏 的状态，而严重依赖葡萄糖酵解为其提供生长所需 的能量的肿瘤细胞因氧和葡萄糖的相对缺乏以及葡 萄糖酵解增加所致的pH降低，引起为折叠蛋白在 内质网中聚集增多，导致肿瘤细胞的内质网应激反 应^[7]。当细胞处于内质网应激状态时，可以激活细 胞内的信号转导系统和相关的降解途径，清除细胞 内积累的错误折叠的蛋白，减弱细胞应激水平，但 是当内质网损伤的程度持续加重不能被恢复时，内 质网应激可以导致细胞死亡^[8]。在神经外胚层肿瘤 细胞中，通过eIF2a-ATF4信号通路调控内质网应激 诱导的细胞凋亡^[9]。ERS通过PERK信号通路介导丝 裂霉素C引起的成纤维细胞凋亡^[10]。

本研究结果发现，通过改变卵巢癌耐药株 SKOV3的ERS功能状态可以影响其对顺铂敏感度。 顺铂可以诱导卵巢癌耐药株SKOV3细胞发生ERS， 联合ERS诱导剂TG与顺铂处理SKOV3细胞，其ERS 相关蛋白表达和凋亡率相对单用DDP组增加。同 时，联合ERS抑制剂TUDCA与顺铂作用于SKOV3 细胞，其ERS相关蛋白表达相对单用DDP组减少， 且其凋亡率也相应降低。在卵巢癌原代细胞中进 行验证，结果与在SKOV3中一致，其相关凋亡蛋白 Cleaved-parp和Cleaved-caspase-3在TG联合DDP组表 达最高，而TUDCA可以减少DDP引起的凋亡蛋白的 表达。另外，本研究结果显示，顺铂可以引起CHOP 蛋白的表达，而且联用TG、TUDCA其表达量会随之 增加或减少，而ERS引起细胞凋亡中，有许多相关通 路参与其中，第一条为CHOP通路，第二条为IRE1- TRAF2-ASK1-caspase12通路，第三条为Ca²⁺通路^[2]。 本研究中CHOP表达增加，我们猜测，在卵巢癌中顺 铂诱导的ERS可能通过该通路引起细胞凋亡，具体 机制还需后续实验进行进一步的验证。

综上所述，ERS在卵巢癌化疗耐药机制方面可 能起到重要作用，为临床肿瘤辅助治疗提供新的 思路与策略。