侵袭转移是恶性肿瘤的生物学特征之一，也 是患者临床致死的主要原因。乏氧与肿瘤转移 显著正相关，但乏氧引起转移增加的具体机制 尚不清楚。同时，乏氧也是引起上皮-间质转化 （epithelial mesenchymal transition,EMT） 的一个重要途径。EMT在肿瘤转移中扮演重要角色，它 是具有极性的上皮细胞转换为活动能力强的间质 细胞并获得侵袭和迁移能力的过程。EMT表型改 变包括上皮标志物如E-钙黏素（E-cadherin）等表 达下调、间质标志物如波形蛋白（vimentin）等表 达增加^{[1, 2]}。锌指转录因子Snail为EMT调控子，通 过与近E-cadherin基因启动子区域的E-boxes结合抑 制E-cadherin表达，诱发EMT^[3]。

非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%，是 世界范围内的主要死因之一。引起肺癌转移的一 个重要原因也不排除其他恶性实体瘤，即乏氧的 存在。目前有关肺癌EMT的研究较少。Snail与乏 氧应答中处于核心地位的乏氧诱导因子-1α（HIF- 1α）关系如何，两者在肺癌EMT中扮演何种角色 尚未见文献报道。本研究采用免疫组织化学技术 检测Snail、HIF-1α和E-cadherin在NSCLC组织中的 表达,探讨其在NSCLC中表达的临床意义及相互关 系，为防治肺癌转移提供依据。 1 资料与方法 1.1 临床资料

收集山东省肿瘤医院2010年2月1日至2011年11 月31日行根治性或姑息性切除术且临床病理资料 完整的原发肺腺癌和肺鳞癌患者切除标本62例， 患者术前均未接受放疗及化疗。研究用组织选取 需避开坏死和出血。取患者距癌组织边缘5 cm的 癌旁组织（均经病理证实无癌细胞浸润） 20例作 为对照。62例患者中，男性44例、 女性18例；患 者年龄38~75岁，平均年龄61岁，中位年龄62岁； 病理类型包括腺癌29例、鳞癌33例。无淋巴结转 移的22例、有淋巴结转移的40例。所有病例均经 病理学检查证实,并按2009年UICC分期标准进行 TNM分期。 1.2 试剂及其来源

兔抗人Snail（ab63371）多克隆抗体和鼠抗人 HIF-1α单抗（ab8366）均购自Abcam公司，兔抗人 E-cadherin多克隆抗体（sc-7870）为Santa Cruz产 品。PV-9000二步法免疫组织化学检测试剂和浓缩 型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公 司。 1.3 免疫组织化学染色

4 μm厚石蜡切片脱蜡水化后进行热介导的抗 原修复。Snail和E-cadherin检测采用EDTA（pH 9.0）抗原修复，HIF-1α检测采用柠檬酸盐缓冲液 （0.01mol /L，pH6.0）抗原修复。3%H₂O₂室温孵 育10 min阻断内源性过氧化物酶活性。用于免疫组 织化学染色的Snail、HIF-1α和E-cadherin抗体稀释 度分别为1:500、1:50和1:100，切片与相应一抗4℃ 孵育过夜，以PBS代替一抗作为阴性对照。染色程 序按试剂盒说明书进行，DAB显色。苏木精对比 染色后将组织切片进行脱水、透明和封固处理。 1.4 结果判定

两位病理医生采用双盲法评价免疫组织化学 染色切片。结果判定依据免疫染色阳性率和强度 进行。Snail和HIF-1α以胞核出现棕黄色染色为阳 性细胞，E-cadherin以胞膜出现棕黄色染色为阳性 细胞。按染色强度的深浅评分：0分无染色；1分 淡黄色；2分棕黄色；3分棕褐色。按阳性细胞百 分比评分：1分：1%~10%；2分：＞10%~50%；3 分：＞50%~80%；4分：＞80%。然后按照阳性细 胞与染色强弱的乘积计积分，≥4分为阳性^[4]。 1.5 统计学方法

采用配对样本的Wilcoxon非参数检验比较癌组 织及癌旁正常组织表达差异,Pearson χ² 检验分析 蛋白表达与NSCLC患者临床病理因素的关系，相 关性用Spearman等级相关分析。统计软件为SPSS 13.0，统计检测均为双侧，P<0.05认为差异有统计 学意义。 2 结果 2.1 肺癌组织Snail、HIF-1α和E-cadherin蛋白表达

Snail和HIF-1α阳性表达主要位于细胞核，见 图 1~2；E-cadherin蛋白阳性表达位于细胞膜，见 图 3。62例肺癌组织Snail和HIF-1α蛋白阳性率分别 为64.5%（40/62）和59.7% （37/62），均高于癌旁 组织阳性率15.0%（3/20）和10.0%（2/20），两者 比较差异有统计学意义（均P<0.05）。E-cadherin 蛋白癌组织阳性率为54.8%（34/62），癌旁组织 为100% （20/20），两者比较差异有统计学意义 （P<0.05）。

A: lung cancer tissues; B: paracancerous tissues 图 1 肺癌组织和癌旁组织Snail染色结果（PV两步法×100） Figure 1 Snail staining in lung cancer tissues and paracancerous tissues(PV two-step assay ×100)

图选项

A: lung cancer tissues; B: paracancerous tissuess; HIF-1α: hypoxiainduced factor-1α 图 2 肺癌组织和癌旁组织HIF-1α染色结果（PV两步法 ×100） Figure 2 HIF-1α staining in lung cancer tissues and paracancerous tissues(PV two-step assay ×100)

图选项

A: lung cancer tissues; B: paracancerous tissue 图 3 肺癌组织和癌旁组织E-cadherin染色结果（PV两步法 ×100） Figure 3 E-cadherin staining in lung cancer tissues and paracancerous tissues(PV two-step assay ×100)

图选项

62例肺癌患者的临床病理特征，包括年龄、 性别、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、临 床分期见表 1。分析显示，Snail和HIF-1α表达升高 及E-cadherin降低与肺癌临床分期和淋巴结转移有 关（P<0.05），E-cadherin表达降低与肺癌分化程 度有关（P=0.044）。三者与其他临床病理参数如 年龄、性别和病理类型均无关（P>0.05）。

表 1 肺癌组织Snail、HIF-1α和E-cadherin蛋白表达与患者临床病理因素的关系 Table 1 Correlation between expression of Snail, HIF-1α, E-cadherin protein in lung cancer tissues and patients’clinicopathologic parameters

表选项

用Spearman等级相关分析，Snail和HIF-1α表 达均与E-cadherin表达呈负相关关系（r=-0.267, P=0.036；r=-0.283,P=0.026），Snail与HIF-1α表 达未见显著相关性（r=0.146,P=0.257）。 3 讨论

乏氧是引起恶性肿瘤转移增加和产生放化疗 抗拒等的重要因素。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亚基 构成的异二聚体，是细胞乏氧情况下调控基因表 达的主要转录因子之一。常、乏氧状态下HIF-1作 用差异主要由HIF-1α亚基的表达和活性决定^[5]。 HIF-1α在多种恶性肿瘤组织高表达，它可通过上 调血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转换因子 （Glut-1）及糖酵解过程中多种关键酶基因，促进 肿瘤组织血管生成和能量代谢，在促肿瘤侵袭转 移方面起重要作用^[6]。本研究结果显示，肺癌患 者癌组织HIF-1α蛋白的表达显著高于癌旁组织， 提示其与NSCLC发生有关。同时本研究还发现， NSCLC癌组织HIF-1α蛋白表达与临床分期和淋巴 结转移有关（P<0.05） ，说明HIF-1α参与NSCLC 进展和转移，HIF-1α过表达患者可能预后不良。

EMT，以上皮细胞丧失极性和获得间质特性 为主要特征，是包括NSCLC在内的多种肿瘤细胞 获得侵袭转移能力的重要机制^{[7, 8, 9]}。E-cadherin表 达下调或丢失是EMT过程中最重要的分子事件。 E-cadherin是一类依赖Ca2+的细胞间粘连跨膜糖 蛋白分子，在维持细胞间黏附稳定性和细胞极性 方面发挥重要作用。与相应正常组织相比，多种 人类肿瘤常见E-cadherin表达完全丧失或下调，E-cadherin表达与转移潜能负相关，被视为肿瘤 抑制基因。锌指转录因子Snail为EMT强诱导子。 Cheng和Blanco等先后发现肿瘤细胞Snail表达和上 皮细胞E-cadherin表达抑制有关，进一步研究发现 Snail通过直接结合E-cadherin转录启动子E-Box区域 发挥抑制E-cadherin表达的作用，这一作用在多种 上皮源性肿瘤细胞株包括乳腺癌、胃癌、肝癌等得 到证实^{[10, 11]}。Castro等对胃癌的研究发现，肿瘤细胞 Snail蛋白表达与胃癌EMT有关，通过抑制E-cadherin 表达，Snail蛋白可促进胃癌间质浸润和远处转移^[3]。 相比于正常组织，本研究发现NSCLC癌组织Snail表 达增高，E-cadherin表达降低，提示E-cadherin低表 达和Snail高表达对肺癌发生可能起重要作用^{[12, 13, 14, 15]}。 有报道显示Snail高表达和（或）E-cadherin低表达与 肺癌患者总生存率降低有关^[13]。本研究发现，两种 蛋白表达均与患者年龄、性别、病理类型无关， 但与淋巴结转移和临床分期有关，与文献报道基 本一致^{[13, 14]}，提示Snail和E-cadherin在肺癌进展和 转移过程中可能发挥重要作用,可作为NSCLC进展 和转移的指标。

同时检测Snail、HIF-1α和E-cadherin在NSCLC 中的表达意义并评价其相关性尚未见报道。本研 究对三种蛋白进行相关分析，发现Snail和HIF- 1α表达均与E-cadherin呈负相关性（P<0.05）。 Ima i 等在卵巢癌组织也发现H I F - 1 α 核染色与 E-cadherin缺失高度相关^[16]。尽管Snail和HIF-1α均 与E-cadherin表达有负相关性，但Snail与HIF-1α表 达未见相关性（P>0.05）。Hung等对87例NSCLC 患者HIF-1α、Snail和Twist表达进行检测，亦未发 现HIF-1α与Snail表达有相关性^[13]。HIF-1α与Snail 的确切关系有待扩大样本例数进一步确定。

总之，本资料显示Snail和HIF-1α高表达、 E-cadherin低表达与NSCLC发生发展和转移有关， 为肺癌临床诊断和预后评估及开发新的肿瘤治疗 靶点提供了依据。