表观遗传学变化是指在核苷酸序列不变的情 况下，基因表达发生可遗传的改变，如DNA甲基 化、组蛋白乙酰化、RNA干扰等。在许多真核生 物中，这是一种基因组用于抵制外源性寄生基因 片段侵袭的保护机制^[1]。作为表观遗传改变的主要 形式，DNA甲基化是哺乳动物遗传外修饰的重要 调控方式，启动子或外显子区CG岛异常甲基化可 导致基因表达沉默、功能丧失和肿瘤发生。

基因组DNA异常甲基化是肿瘤发生发展过程 中的一个早期事件，因而在早期诊断和预后方面 具有广阔的应用前景^{[2, 3]}。近年来DNA甲基化在医 学研究领域倍受关注，在研究方法上也取得突破 性进展，基因芯片的研发为大规模检测海量位点 提供了可能。以Illumina公司的450K甲基化芯片为 例，该芯片设计了485 577个甲基化位点，覆盖了 96%的CG岛，常被用于前期特异性基因和位点的 筛选。为探讨其在构建食管鳞状细胞癌异常甲基 化谱中的作用，我们进行了该项研究。 1 资料与方法 1.1 芯片初筛

从上消化道癌高发区江苏省扬中市选择5例 经病理学确诊的食管鳞状细胞癌患者。手术时分 别留取癌灶中心和切口远端肉眼正常食管黏膜组 织，低温冻存。同时在参加当地社区早期癌症筛 查的人群中留取2例正常食管黏膜组织为对照。 组织经研磨、匀浆后提取基因组DNA，亚硫酸氢 盐转化后经过扩增、断裂、沉淀、重悬，在450K 甲基化芯片上经过杂交、洗涤、延伸、染色、扫 描等过程，获得DNA甲基化信号。信号采集与分 析采用GenomeStudio^®甲基化分析系统。针对每个 CG位点设计两种探针，用双色荧光信号检测甲基 化和非甲基化等位基因，采用杂交质控图和背景 图来检测实验效果。差异甲基化基因的筛选标准 为：实验组与对照组其中任何一组中为有效基因 （P<0.05），且实验组样本差异分值（Diffscore） 小于-13或大于13，甲基化β差值（Delta Beta）大于 0.17或小于-0.17。差异分值大于13且甲基化β差值 大于0.17为差异甲基化位点。 1.2 质谱法验证

另取11例食管鳞状细胞癌灶中心组织和3例正 常对照，采用Sequenom质谱法对初筛出的位点进 行验证。基本步骤包括：亚硫酸盐处理；PCR扩 增甲基化区域片段；虾碱性磷酸酶反应；碱基特 异性酶切反应；纯化；点样；质谱芯片检测；数 据文件导出与分析。 2 结果 2.1 差异甲基化位点与基因组注释区域的分布

芯片检测的485 577个位点对应365 860个基因， 根据甲基化β差值和差异分值的筛选条件，食管鳞状 细胞癌组织和正常食管黏膜组织存在约4%差异甲基 化位点，高甲基化位点主要分布在基因体和启动子 区，低甲基化位点主要分布在启动子区和其他区域， 见表 1。平均每个高甲基化位点对应1.6个功能性位 点；1个低甲基化位点对应2.2个功能性位点。启动子 区的高甲基化位点主要分布在转录起始位点1 500 bp 和5’非翻译区（UTR），低甲基化位点主要在转录起 始位点200 bp和5’UTR，见表 2。CG岛周围区域也有 高甲基化现象，根据CG含量和距离远近分为岛滩区 和岛架区。高甲基化位点主要分布在CG岛滩区，低甲 基化位点主要分布在CG岛，见表 3。

表 1 食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜组织甲基化位点的分布特征 Table 1 Distribution of methylated sites in ESCC and normal mucosa tissues

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表 2 食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜组织甲基化位点在基因启动子区的分布特征 Table 2 Distribution of methylated sites in gene promoter region in ESCC and normal mucosa tissues

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表 3 根据CG岛划分食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜甲基化区域的分布特征 Table 3 Distribution of methylated sites in ESCC and normal mucosa tissues based on CG island

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根据食管鳞状细胞癌组织和正常食管黏膜对照 间甲基化差异值，结合Genecards、Intogen等数据库筛 选出用于后续验证的候选异常高甲基化基因，见表 4。

表 4 芯片筛选出的食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜组织异常甲基化基因谱 Table 4 Aberrant methylation panel of genes in ESCC and normal mucosa tissues screened by genechip technology

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选择AIM2和CASZ1基因采用质谱法验证，结 果显示AIM2基因的3个甲基化位点甲基化频率在病 例和对照中的差异均无统计学意义。芯片检测中 发现的CASZ1_CpG_5位点及其周围的多个CG位点 的甲基化频率均表现为肿瘤组织高于正常对照， 见表 5。

表 5 质谱法验证食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜组织甲基化频率的结果 Table 5 Validation result of methylation in ESCC and normal mucosa tissues using mass spectrometry

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食管鳞状细胞癌早期多无明显症状与体征， 一旦确诊大都已是中晚期，患者预后不佳。因此 寻找敏感、特异的早期生物标志物对于食管鳞状 细胞癌早期诊断具有重要价值。甲基化芯片有助 于从海量的CG位点中筛选出有潜在应用价值的基因，然后进行评价并最终实现临床转化。

本研究发现，食管鳞状细胞癌组织异常高甲 基化位点主要分布在基因体，低甲基化位点主要 分布在启动子区。启动子区高甲基化位点主要在 TSS1500和5’UTR区域，低甲基化位点主要在启动 子的TSS200和5’UTR。近年研究发现，在CG岛和 岛滩外的其他区域也有分布，且这些区域的甲基 化与基因表达也存在关联^[4]。本研究结果显示，发 生在岛滩的高甲基化位点多于CG岛。既往研究发 现，岛滩区甲基化程度在不同癌症患者中不一致^[5]， 与基因表达的关系可能比CG岛更强^[6]。

通过芯片技术初筛出10个具有潜在应用价值的 差异甲基化基因，这些基因涉及众多的肿瘤相关生 物学过程。例如，ING2是生长抑制剂家族一员， 与细胞生长停滞、凋亡和DNA修复有关，可以激 活p53及其介导的凋亡通路，是一个重要的抑癌基 因^[7]，其表达缺失和头颈部鳞癌^[8]和黑色素瘤^[9]有 关。AIM2和炎性反应相关，能够抑制核因子和增 加G1期细胞群，诱导细胞凋亡，抑制乳腺肿瘤细胞 的生长^[10]。CDH13是钙黏蛋白家族成员，在食管 鳞状细胞癌组织中的表达量明显低于癌旁和正常 食管黏膜组织^[11]。KLF6是一个锌指肿瘤抑制子， 涉及到细胞分化和发育以及生长信号转导、细胞 凋亡和血管生成，既往研究发现与胃癌^[12]、前列腺 癌^[13]、以及大肠癌^[14]相关。TRIT1负责tRNA的异戊 酰基转移，该基因与肺癌的发生有关^[15]。TMEFF2 高甲基化在胶质瘤、卵巢癌、直肠癌、结肠癌和 肺癌中均有报道^[16]，且在食管鳞状细胞癌组织中 甲基化程度显著高于癌旁组织，去甲基化后mRNA 的表达增加^[17]。CASZ1是与神经母细胞瘤有关的 候选抑癌基因^[18]。ADAMTS9是金属蛋白酶家族成 员，与鼻咽癌及淋巴结转移有关^[19]，在胃癌、大肠 癌、胰腺癌中均存在高甲基化现象^[20]，研究表明发 现ADAMTS9的抑癌功能和抑制血管生成有关^[21]。 EBF3能诱导细胞周期停滞和凋亡^[22]，可能参与转 化生长因子β信号转导通路。IQGAP2是含IQ基团 的GTP酶激活蛋白2，在细胞黏附、迁移、侵袭和 癌细胞转移中起着举足轻重的作用，在原发性胃癌 中，有47%的患者被检测到异常高甲基化^[23]，在肝癌^[24]和前列腺癌^[25]中可观察到其表达缺失。

基因芯片在技术可靠性得到保证的基础上， 具有高敏感度、高通量的特点，但由于价格因素 和数据处理、挖掘困难，目前尚未广泛应用于常 规样本检测，多用于前期筛选。基于芯片初筛获 得的差异甲基化位点，需要进一步扩大样本进行 验证和评估。本研究中，芯片初筛发现的两个差 异甲基化位点有1个在质谱法验证中仍具有统计学 意义。提示构建应用于食管鳞状细胞癌诊断与预 后的异常甲基化谱需经过不同人群、大样本、多 阶段的验证和评价，才能最终实现向临床应用的 转化。