胶质瘤亦称神经胶质细胞瘤，是最常见的颅 内恶性肿瘤（约占60%），具有发病率、复发率、 死亡率高和治愈率低等特点，即使手术切除结合 综合治疗，平均带瘤生存时间超过5年的却不到 50%^[1]，是威胁人类生存的神经系统主要疾病之 一。目前对于影响胶质瘤预后的具体分子生物学 机制尚不清楚。

近年来，感染性炎症因子、细胞因子以及细胞 因子间的网络调控在肿瘤的发生发展中越来越受到 重视。白介素1受体辅助蛋白（interleukin 1 receptor accessory protein,IL-1RAP）是IL-1信号通路的一种辅助蛋白^[2]，本课题组既往研究发现IL-1RAP在胶 质瘤中有明显抑癌作用^[3]。信号转导和转录活化因 子3（ signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）是一种转录因子，在调节细胞多种 生物学功能方面起重要作用。本研究将在既往研 究的基础上进一步在胶质瘤细胞系U251中验证IL- 1RAP的抑癌作用及其与STAT3的相关机制。 1 材料和方法 1.1 材料

人神经胶质细胞瘤U251细胞购自中国医学科 学院基础医学研究所细胞中心，IL-1RAP抗体、二 抗购自英国Abcam公司，STAT3抗体购自美国CST 公司。Protein A/G agarose、凋亡和周期试剂盒购 自美国Invitrogen公司。RIPA试剂购自中国碧云天 公司。DH5α感受态细胞、LB培养液、kana+抗生 素、BHI琼脂平板培养液、BCA蛋白定量试剂盒 均购自中国普利来公司。FITC和TRITC标记的二 抗购自中国中杉金桥公司。TurboFect Transfection Reagent转染试剂购自加拿大Fermantas公司。细胞 用血清和培养液购自美国Gibco公司。质粒提取并 去除内毒素试剂盒（EndoFee Plasmid Mini Kit）购 自美国Omega公司。 1.2 IL-1RAP质粒制备和转染

IL-1RAP质粒的构建与质检均由Origin公司完 成，并出具质检报告。质检方法为利用构建的质 粒与空质粒分别转染HEK239细胞，再利用PCR和 Western blot检测IL-1RAP的RNA和蛋白表达情况。 经检测转染构建质粒组IL-1RAP的RNA和蛋白均表 达，表明质粒制备及转染成功。

利用IL-1RAP质粒转化DH5α感受态细胞， 将转化的菌液按照1:100体积接种于kana+抗性LB 培养液中，37℃摇床培养10 h。取10 ml菌液， 按照质粒提取并去除内毒素试剂盒（EndoFee Plasmid Mini Kit）说明书操作。将洗脱下的 DNA定量-20℃分装保存用于转染。并利用PCR 对质粒进行鉴定，IL-1RAP引物序列：上游： 5’-TATGCCTGCCTTTGGTAC-3’；下游：5’-CATT TCCCTTGAATGTTCT-3’。

根据TurboFect Transfection Reagent试剂说明 书，将U251细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度均匀种 植于6孔板中，37℃培养12 h。按照每孔50 μl无血 清MEM培养液与5 μl转染试剂和3 μl质粒的混合物 进行转染，以空载体作为阴性对照，以荧光显微 镜观察GFP标签表达情况计算转染效率。转染质粒 37℃培养12 h进行下一步实验。将6孔板中转染IL- 1RAP质粒的U251细胞在荧光显微镜高倍视野下 （×400）观察，于可见光下固定一个视野，计数 细胞总数，转换荧光光源计数携带GFP绿色荧光的 细胞数，转染效率＝有荧光表达的细胞数/细胞总 数×100%，每孔细胞随机选择5个观察视野，重复 3次^[4]。 1.3 流式细胞分析IL-1RAP对U251细胞周期的影响

将转染IL-1RAP质粒和空载体的U251，用胰 酶消化细胞，清洗，重悬细胞，加入1 ml 70%乙醇 中-20℃固定过夜。收集细胞并重悬。每管细胞样 品中加入0.5 μl碘化丙啶（PI）染色液，37℃避光 温浴30 min。冰浴避光存放。流式细胞仪分析时以 未作处理的U251细胞圈门，通过流式细胞仪分析 对比转染IL-1RAP组和转染空质粒的对照组各设3 个平行对照。 1.4 流式细胞分析IL-1RAP对U251细胞凋亡的影响

将转染IL-1RAP质粒和空载体的U251，用 胰酶消化细胞，清洗，重悬细胞，取1×10⁵的细 胞，加入195 μl Annexin V-FITC结合液重悬。并 加入5 μl Annexin V-FITC，加入10 μl PI染色液， 轻轻混匀，避光放置室温孵育30 min。流式细胞 仪分析时以未作处理的U251细胞圈门，通过流式 细胞仪分析对比转染IL-1RAP组和转染空质粒的 对照组各设3个平行对照。 1.5 免疫共沉淀分析IL-1RAP与STAT3的关系

RIPA裂解液在使用前数分钟内加入PMSF， 使PMSF的最终浓度为1 mM。去除转染过后U251 细胞培养液，用PBS液洗一遍，按照6孔板每孔 加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。蛋白样品 应用BCA法进行定量。每1 ml总蛋白中加入100 μl Protein A/G agarose，4℃摇晃1 h，以去除非 特异性杂蛋白，去除Protein A/G珠子。上清液加 入IL-1RAP抗体和STAT3抗体各5 μl并加入100 μl Protein A/G agarose，4℃缓慢摇动抗原抗体混合 物过夜。收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清 液。用60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体 复合物悬起，轻轻混匀，将样品煮10 min。收集 上清液，将上清液电泳。 1.6 免疫荧光检测IL-1RAP与STAT3的共定位

将转染后的U251细胞用PBS洗3次。加入4%多 聚甲醛200 μl于4℃固定20 min。在固定好的细胞中 加入200 μl的0.5% Triton X-100于4℃通透15 min。 用3% BSA于37℃封闭1h，洗净封闭液。加入IL- 1RAP抗体和STAT3一抗于4℃孵育过夜。加入FITC和TRITC标记的二抗37℃避光孵育30 min，此步骤 之后尽量避光操作。用甲醇稀释的DAPI洗一次， 加入新的甲醇稀释的DAPI于37℃避光孵育10 min甲 醇，用甲醇洗一次。稍晾干后用 50%甘油封片。激 光共聚焦显微镜镜检。 1.7 统计学方法

用SPSS19.0 软件进行t检验，比较细胞周期和 细胞凋亡数据，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 IL-1RAP转染效率计算结果

根据流式细胞仪检测结果计算IL-1RAP质粒在 U251细胞中的转染效率为（56.9±5.1）%。 2.2 流式细胞仪分析IL-1RAP对U251细胞形态学的影响情况

流式细胞仪分析发现转染IL-1RAP组细胞凋亡 百分比为（52.10±5.51）%，而转染空质粒的对照组细 胞凋亡百分比为（7.57±0.54）%。转染IL-1RAP组细 胞凋亡百分比明显增加（P＜0.05），见图 1。

A: transfected with blank plasmid; B: transfected with IL-1RAP 图 1 转染IL-1RAP对U251细胞凋亡的影响 Figure 1 The impact of IL-1RAP transfection on U251 cell apoptosis

图选项

流式细胞仪分析发现，转染IL-1RAP组细胞S 期细胞百分比为（68.22±1.96）%而转染空质粒的 对照组细胞S期细胞百分比为（38.31±7.22）%。 转染IL-1RAP组细胞S期百分比明显增加，转染IL- 1RAP使细胞停留在S期抑制其进一步的细胞分裂 （P＜0.05），见图 2。

A：transfected with blank plasmid；B：transfected with IL-1RAP 图 2 转染IL-1RAP对U251细胞周期的影响 Figure 2 The impact of IL-1RAP transfection on U251 cells cycle

图选项

IL-1RAP抗体和STAT3抗体分别钓取转染IL- 1RAP组和转染空白质粒组细胞总蛋白，IL-1RAP 抗体在转染组钓取到STAT3和IL-1RAP，说明存 在IL-1RAP的情况下STAT3可以和IL-1RAP结合。 STAT3抗体在转染组钓取到STAT3和IL-1RAP说明 存在STAT3的情况下IL-1RAP可以和STAT3结合， 并且转染IL-1RAP后STAT3表达量有所提高。通过 免疫共沉淀证实了IL-1RAP和STAT3之间在细胞内 可以相互结合。在转染空白质粒组利用STAT3抗体 钓取到STAT3蛋白说明STAT3在未转染IL-1RAP的 胶质瘤细胞系U251中也有表达，而IL-1RAP几乎 没有表达，见图 3。

A: transfected with blank plasmid; B: transfected with IL-1RAP 图 3 IL-1RAP和STAT3免疫共沉淀结果 Figure 3 Co-immunoprecipitation of IL-1RAP and STAT3

图选项

在免疫荧光共定位实验中，利用激光共聚 焦显微镜观察，IL-1RAP与FITC标记的二抗相结 合，在波长495 nm的激光下观察产生绿色荧光； STAT3与TRITC标记的二抗相结合，在波长550 nm 的激光下观察产生橘红色荧光；细胞核与DAPI相结合，在波长340 nm的激光下观察产生蓝色荧 光。通过激光共聚焦显微镜观察，在转染IL-1RAP 组，代表STAT3表达水平的橘红色荧光与明场视 野基本一致，说明STAT3为全细胞表达，代表IL- 1RAP表达水平的绿色荧光与代表细胞核的蓝色荧 光视野一致说明IL-1RAP为细胞核表达，绿色荧光 与橘红色荧光较强的部位视野一致说明二者有共 定位信号，见图 4-1。在转染空白质粒的对照组可 见橘红色荧光说明有STAT3表达；但是未见绿色 荧光说明未见IL-1RAP表达，见图 4-2。

A: DAPI; B:IL-1RAP; C: STAT3; D: Bright field; E: DAPI+IL-1RAP; F: IL-1RAP+STAT3; 1: transfected with IL-1RAP; 2: transfected with blank plasmid 图 4 免疫荧光检测STAT3与IL-1RAP共定位 Figure 4 Colocalization of STAT3 and IL-1RAP detected by immunofluorescence

图选项

IL-1RAP是IL-1信号通路的一种辅助蛋白。近 年来，对IL-1RAP的研究主要集中于其在IL-1信号 转导通路中的作用^[2]，其抗肿瘤作用却报道不多。 Kim等^[5]曾报道在肾癌IL-1RAP的表达水平镜像反 映了Wilms’肿瘤抑制基因（WT1）的表达水平。 Järås等^[6]研究发现利用单克隆抗体靶向IL-1RAP能 够对慢性粒细胞白血病干细胞产生杀伤作用。有 报道称IL-1RAP可以使免疫器官更加敏感从而提 高免疫反应和免疫应答^[7]。本课题组既往研究证实 IL-1RAP在儿童低级别胶质瘤中表达水平明显高于 成人低级别胶质瘤，并发现IL-1RAP在胶质瘤中 具有抑癌作用^[3]。本研究利用IL-1RAP转染U251细 胞发现转染IL-1RAP组细胞凋亡百分比为（52.10 ±5.51）%，而转染空质粒的对照组细胞凋亡百分 比为（7.57±0.54）%。说明转染IL-1RAP可以明显 促进细胞凋亡（P＜0.05）。转染IL-1RAP组细胞S 期百分比为（68.22±1.96）%，而转染空质粒的对 照组细胞S期百分比为（38.31 ±7.22）%。转染IL- 1RAP组细胞S期百分比明显增加，转染IL-1RAP可 以使细胞停留在S期抑制其进一步的细胞分裂。转 染IL-1RAP主要造成细胞的S期阻滞（P＜0.05）。 结合以上结果表明IL-1RAP的核定位后抑制了细胞 的分裂，从而导致了U251细胞的凋亡。在进一步 的研究中我们发现转染后IL-1RAP主要表达于U251 细胞的细胞核，这与本课题组既往报道的IL-1RAP 在胶质瘤组织中的表达定位一致^[3]。通常情况下 IL-1RAP通过分泌到细胞外发挥其生物学功能^[8]， 然而无论是在胶质瘤组织中还是在胶质瘤细胞系 U251细胞中IL-1RAP均为胞核表达。一般认为核 定位信号（NLS）是核内功能蛋白进入细胞核的 结构基础^[9]。由于常规核定位信号序列在构成特点 上具有明显的规律性，因而通过生物信息学的手 段容易预测^[10]，而通过生物信息学的手段预测IL- 1RAP蛋白没有细胞核定位信号。

STAT3是一种在调节发育、分化、增殖和 细胞凋亡等生物学功能方面起重要作用的转录 因子^[11]。Dasgupta等^[12]的研究发现在异常活化的 STAT3不仅导致肿瘤发生，而且还通过抑制细胞 免疫使肿瘤细胞免疫逃逸。另一方面STAT3作为 细胞自我改造的一种代偿性、适应性的反应抑制 细胞生长的功能，减缓肿瘤形成过程。STAT3在 某些情况下还有促进细胞死亡的作用，从而揭 示了STAT3有潜在的肿瘤抑制功能。当乳腺上皮 细胞缺乏STAT3时细胞凋亡明显抑制^[13]。本研究 中发现STAT3和IL-1RAP在U251细胞系中具有共 定位信号，并且能够相互结合。研究证实STAT3 能够促进神经干细胞分化为星形胶质细胞^[14]。在 STAT3基因对胶质瘤影响的研究中发现，过量表 达STAT3可以促使胶质母细胞瘤沿着星形胶质细 胞方向分化。敲除STAT3的星形胶质细胞与STAT3过表达的星形胶质细胞相比，其增殖和侵袭的能 力都有明显的增强，表明STAT3有抑制星形胶质 细胞的增殖和侵袭的作用^[14]。本研究中发现在未 转染IL-1RAP的胶质瘤细胞中也有STAT3表达， 但并未引起胶质瘤细胞的凋亡和细胞周期阻滞现 象，而转染IL-1RAP后STAT3的表达水平亦有提高 并且出现了胶质瘤细胞的凋亡和细胞S期阻滞。说 明在胶质瘤细胞中STAT3与IL-1RAP结合发挥作用 引起了胶质瘤细胞的凋亡和细胞周期阻滞，二者 之间可能存在反馈调节机制。目前认为二聚化的 STAT3可以进入细胞核，结合在基因启动子的特 定序列上，通过与其他转录调控元件的相互作用 来调控基因的表达^[15]。在没有信号分子刺激的情 况下，STAT3分子主要分布在胞质中。受IL-6等细 胞因子的刺激后，数分钟内发生磷酸化而聚集在 细胞核内 ^[16]，而IL-1RAP可以促进IL-6的产生^[17]。 经典NLS包括一段单价的碱性氨基酸或双价的碱 性氨基酸^[18]。STAT3的DNA结合域具有一段这样 的序列。但是STAT3与IL-1RAP在低级别胶质瘤中 的具体作用机制还有待我们进一步研究。

综上所述，本研究发现IL-1RAP有抑制胶质瘤 细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。IL-1RAP可能通 过与STAT3相互作用进入细胞核进一步发挥其生物 学作用。由此推测 IL-1RAP 和STAT3在胶质瘤的 发生、发展过程中发挥了重要作用，可为胶质瘤 的治疗提供客观依据和可能的药物靶点。