树突状细胞（dendritic cell,DC）是目前已知的抗原提呈功能最强的细胞，可以激活初始的T细胞。将肿瘤抗原、细胞因子等基因导入树突状细胞可增强其对T细胞的免疫激活作用，增强特异性抗肿瘤免疫应答。本实验通过重组腺病毒将RPL8基因导入DC，制成RPL8基因修饰的DC，注入胶质瘤荷瘤小鼠体内，探讨RPL8基因修饰的DC对荷瘤小鼠的免疫治疗作用，为胶质瘤的免疫治疗提供新的思路。1 材料与方法1.1 材料

重组小鼠 粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子（rmGM-CSF）和重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）购于R&D公司；胎牛血清、RPMI 1640、DMEM/F12使用Hclone公司产品。GL261胶质瘤细胞、重组腺病毒Adxsi-EGFP-RPL8（Ad-RPL8）由本室保存。C57BL/6小鼠购自第三军医大学大坪医院实验动物中心。1.2 小鼠骨髓来源DC的分离培养

脱颈处死C57BL/6小鼠，无菌剥离股骨、胫骨及肱骨，用无菌PBS液反复冲洗髓腔，冲洗液用200钼钢网过滤。收集骨髓细胞，加入0.84%TrisNH4Cl裂解红细胞，PBS洗涤2次，用含rmGMCSF、rmIL-4的RPMI 1640培养液重悬细胞。第6天加入LPS（200 ng/ml）刺激细胞成熟。1.3 RPL8基因修饰DC的制备

收集培养到第8天的DC，加入MOI150的重组腺病毒Ad-RPL8及对照腺病毒Ad（带EGFP），置于37℃、5%CO2培养箱中培养2 h，感染结束后，洗去残余的病毒液，加入完全培养液继续培养。荧光显微镜观察DC内绿色荧光，观察病毒是否转染成功。收集细胞（即DC-RPL8），RT-PCR分析细胞中RPL8 mRNA表达。1.4 RPL8修饰DC诱导T细胞杀伤效应

常规培养胶质瘤细胞，将细胞密度调节至1×10⁵/ml，加入96孔板中，每孔100 μl，培养24 h。实验分为3组：（1）PBS组：PBS+DC；（2）Ad组：Ad感染DC；（3）Ad-RPL8组：Ad-RPL8感染DC。

感染后DC与T细胞以1:3比例混匀在培养箱内培养72 h。分别按效靶比为10:1、20:1、30:1加入培养于96孔板的GL261胶质瘤细胞中，每组设3个复孔。培养48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT各20 μl，继续培养4 h，加入100 μl DMSO，570 nm波长处测定各组的OD值。T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应用抑制率表示，抑制率=[靶细胞对照组A值-（实验组A值-效应细胞对照组A值）]/（靶细胞对照组A值）×100%。1.5 RPL8基因修饰DC对胶质瘤的免疫效应

将GL261细胞培养传代，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，将细胞悬液接种于C57BL/6小鼠右前腋下，每只0.2 ml（2×10⁶个细胞），隔天观察肿瘤的生长情况，一般5天后可在注射部位摸到米粒样大小的包块，即为荷瘤模型。荷瘤5天后，尾静脉注射RPL8基因修饰DC，每只200 μl。同时设空载体对照和PBS对照，每组5只。每周1次，共3次，每隔3天观察肿瘤体积变化及小鼠的生存情况，取瘤体进行石蜡包埋、病理切片、HE染色。1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，各组数据以x±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 荧光显微镜观察RPL8基因修饰的DC

DC经重组腺病毒感染后，培养初期可见较多的小而圆形贴壁细胞，随着培养时间的延长，细胞形态明显改变，继而出现集落样的生长，表面伸出典型的树枝样突起。重组病毒Ad-RPL8和空载病毒（Ad）感染DC后，细胞内可见绿色荧光，表明腺病毒成功感染DC，见图 1。

A: morphological character of dendritic cells(DCs); B: DCs infected by pAd-RPL8 图 1 重组腺病毒感染后的树突状细胞（×200） Figure 1 DCs infected by recombinant adenovirus (×200)

图选项

收集重组腺病毒感染后DC，提取细胞RNA，RT-PCR扩增出大小约309 bp的特异性条带，见图 2。

M: marker; 1-2: Ad-RPL8; 3: Ad图 2 RT-PCR分析树突状细胞中RPL8 mRNA的表达 Figure 2 RPL8 mRNA expression in DCs detected by RTPCR

图选项

当效靶比为30:1时，Ad-RPL8感染DC激活T细胞对GL261细胞的抑制效率最高为78%，Ad感染DC体外刺激T细胞对GL261细胞的抑制率为49%，PBS组对GL261细胞的抑制率为43%。RPL8基因修饰DC诱导的T细胞杀伤效应与Ad组、PBS组比较差异有统计学意义（P＜0.01），Ad组与PBS组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图 3。

图 3 RPL8基因修饰树突状细胞诱导的T细胞杀伤效应 Figure 3 Cytotoxic effect of T cells induced by DC modified by RPL8 gene

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C57BL/6小鼠腋下皮下接种GL261细胞5天后，所有小鼠的接种部位均出现直径0.2~0.3 cm大小的肿瘤结节。尾静脉注射DC-RPL8 200 μl后，PBS组和Ad组荷瘤小鼠出现进食减少，精神萎靡，逐渐死亡。RPL8基因修饰DC组荷瘤小鼠的肿瘤体积明显小于Ad组与PBS组（P＜0.01），见表 1。经RPL8基因修饰DC治疗的小鼠的生存期明显延长，2只小鼠肿瘤生长缓慢，分别存活55天和60天，其余小鼠的肿瘤逐渐消失，实验结束90天后仍然存活，而Ad组和PBS组肿瘤生长快，瘤体表面出现大小不等的糜烂、出血，35天左右死亡，见图 4。

表 1 RPL8基因修饰DC治疗后荷瘤鼠肿瘤体积的变化(cm³) Table 1 The changes of tumor volume after the treatment with DC modified by RPL8 gene(cm³)

表选项

图 4 各组荷瘤鼠的生存时间 Figure 4 Thesurvival time of tumor-bearing mice

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RPL8基因修饰DC组荷瘤小鼠肿瘤组织经HE染色，可见肿瘤细胞肿胀、坏死、崩解较多，胞核淡染，在肿瘤细胞间及瘤组织间质内可见有大量的淋巴细胞浸润，出现大片的溶解、坏死灶。PBS组和Ad组可见核异质性明显，核大而深染，呈浸润性生长，细胞排列紊乱，淋巴细胞浸润少，见图 5。

A: PBS group. Nuclear marked heterogeneity,large nuclei and deep staining,cells arranged in disorder; B: Ad group:DCs infected by Ad. Nuclear marked heterogeneity,large and hyperchromatic nucleus,showing invasive growth; C: Ad-RPL8 group: DCs infected by Ad-RPL8. Tissue interstitial lymphocytes,dissolve and focal necrosis图 5 各组荷瘤小鼠肿瘤组织病理学检查结果（HE ×200）Figure 5 Pathological examination of mice tumor tissues （HE ×200）

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随着分子生物学和免疫学研究的不断深入，肿瘤的免疫治疗已成为继手术、化疗、放疗后发展起来的第四种疗法。树突状细胞是机体免疫应答反应的重要细胞，是唯一能直接激活初始T细胞的抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫应答的启动及调控中起着极其关键的作用^[1,2,3]。DC表面富含MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子，与抗原肽结合后免疫小鼠可激活CD4⁺T和CD8⁺T细胞，诱导产生特异性抗肿瘤细胞免疫和体液免疫以抑制肿瘤细胞的生长^[4,5]。研究较多的DC疫苗主要包括肿瘤抗原肽致敏的DC及肿瘤抗原基因修饰的DC等^[6,7]。利用腺病毒将肿瘤抗原基因导入DC，可使抗原在细胞内稳定表达，并具有安全无不良反应等特点^[8]。但目前研究的DC疫苗要达到较高的肿瘤治愈率尚有相当的距离，究其原因可能主要是这些DC疫苗诱导抗肿瘤免疫的能力，特别是诱导细胞毒性（CTL）反应的能力还不稳定，而这种不稳定则主要与肿瘤抗原的选择有关。

最近研究发现，RPL8高表达于黑色素瘤和胶质瘤等，RPL8能被CD4⁺HLA-DR7限制性Th细胞识别，可刺激HLA-DR7⁺黑色素瘤患者外周血单个核细胞增殖并表达细胞因子^[9]。通过分子结构扫描分析，RPL8可能包含其他能与HLA-Ⅰ类分子（A1、A 2、A24、B7、B44、B51）结合的表位，提示RPL8可作为肿瘤抗原用于RPL8阳性肿瘤患者的治疗。本实验采用重组腺病毒Ad-RPL8感染小鼠骨髓来源DC，观察RPL8基因修饰的DC在体外诱导T细胞对靶细胞的杀伤效应，以及在体内对胶质瘤的免疫治疗作用。RPL8基因修饰的DC在荷瘤小鼠体内能抑制肿瘤生长，小鼠生存期明显延长，PBS组、Ad组小鼠在35天左右死亡，而RPL8修饰的DC组在60天后仍有50%存活。体外实验发现，RPL8基因修饰的DC能激活T细胞，抑制GL261胶质瘤细胞的生长，表明RPL8基因修饰的DC可诱导小鼠产生抗肿瘤免疫反应。该实验结果可为胶质瘤的免疫治疗提供新的思路。